从甘蔗渣泥中分离降解木质素的真菌

采用涂布平板法从甘蔗渣泥中共分离得到5株优势真菌,分别为头孢霉属(Cephalosporium)、曲霉属(Asper-gillus)、木霉属(Trichoderma)、毛霉属(Mucor)和地霉属(Geotrichum)。对分离得到的真菌进行产酶特性的研究。采用两种不同的产酶培养基(培养基V,培养基VI),这两种培养基的无机盐成分、含量相同,它们的主要差别为碳源不同。培养基V的主要碳源为葡萄溏,培养基VI的主要碳源为甘蔗渣(过60目筛)。结果表明:分离得到的真菌在这两种培养基中的产酶酶活力相差很大,最优菌株为木霉属Q-3,在培养基VI中产酶酶活最高,赖锰过氧化物酶和漆酶最高活性分别为4.2245U/mL、1.2525U/mL,相对应的纤维素酶活性较低。

列控中心接口故障分析

列控中心是列车运行控制系统的核心设备,其通过不同类型的接口与其它系统连接,传递相关控制信息,因此列控中心接口技术对整个列车运行控制系统十分关键。列控中心接口故障可能涉及的系统较多,对行车的影响大,技术又比较复杂。针对这一情况,文章以列控中心与联锁、调度集中、ZPW-2000轨道电路的接口为例,分析其接口构成、通信机制,从而掌握每一种接口类型的特性,以便更好地处理接口故障;再以一些典型列控中心接口故障为例,结合多种诊断方法,分析故障发生的原因,制定排除故障的方法和步骤,并提出故障处理措施。最后,结合列控中心现场应用情况,提出减少接口故障的建议与意见,从而大幅减少列控中心接口故障,即使出现故障,也能及时得到正确地处理。

TDCS/CTC系统通道状态检测技术研究

目前针对TDCS/CTC系统通道维护手段的研究还停留在常见故障分析阶段,缺乏专业的通道智能检测技术。本文提出一种实现TDCS/CTC、集中监测系统等常用通信接口全兼容、常用通信协议全兼容、通道状态检测及故障分析定位的便携式通道检测系统。该系统吸收了国内外通道状态研究的先进经验,并从多方面进行原始创新,在1台便携设备上实现了2M电通道、光纤通道数据分析、仿真测试等功能,为电务人员现场处理故障提供了便利。

C5补体抑制剂OmCI的重组表达、纯化和活性研究

OmCI(Ornithodoros moubata complement inhibitor,1)是靶向补体C5的药物,用于治疗补体介导的疾病。该研究建立了1的重组、表达、分离、纯化方法,并对其进行活性验证。采用重组大肠埃希菌高密度发酵技术,以胞外可溶形式表达1,融合蛋白的发酵表达产量为317 mg/L。发酵上清经调酸预处理、酶切去除标签蛋白,阴离子交换色谱、反相色谱纯化后得到纯度为98.2%的目的蛋白,总收率为62.8%。目的蛋白经质谱验证,相对分子质量正确;采用体外补体经典途径的抑制试验测得IC50值为8.59 nmol/L,与补体C5的结合常数(KD)为4.74 nmol/L,证明其在大肠埃希菌中成功表达,且具有C5抑制活性。该研究为C5补体抑制剂类药物的高效制备提供了参考。

催化合成西格列汀的转氨酶基因的克隆表达

将可催化合成西格列汀的转氨酶基因克隆到表达载体p GEX-6p-1上,并转入大肠杆菌E.coli中表达,获得高效表达重组转氨酶的菌株。分别考察基因在不同大肠杆菌[E.coli W3110、E.coli BL21(DE3)、E.coli Rosetta(DE3)和E.coli Rosetta-gami2(DE3)]中的表达情况,结果显示,转氨酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达量较高,而且多为可溶性表达。所得重组转氨酶(粗酶)比活力也较高,为0.32 u/mg。

菌株SIPI-2013406的次级代谢产物分离纯化与菌种鉴定

利用阴离子交换色谱和反相C_(18)色谱柱纯化菌株SIPI-2013406的代谢产物,获得纯度高于98%的化合物样品。采用质谱和核磁共振鉴定结构,推测该产物为富马酰-L-丙氨酸。产生菌经过形态和分子特征鉴定,确定菌株SIPI-2013406为产黄青霉种(Penicillium chrysogenum)。

酿脓链球菌Cas9核酸酶的重组表达、分离纯化及酶学特性

【背景】Cas9核酸酶是一种RNA引导的核酸内切酶,可与单链向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)形成稳定的核糖核蛋白复合物,识别和切割特定的核苷酸片段。由于其具备高灵活性和高效率的特点,目前已经成为基础科学研究领域和临床治疗方法中使用最广泛的基因编辑工具。【目的】为Cas9核酸酶的合理开发和利用提供理论依据。【方法】利用大肠杆菌表达系统表达野生型酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9核酸酶,经硫酸铵沉淀和镍柱亲和层析两步纯化获得较高纯度表达产物,并对其热稳定性、pH稳定性、金属离子的影响等酶学特性进行研究。【结果】经高密度发酵后,大肠杆菌湿菌重达191.0 g/L。纯化后酿脓链球菌Cas9核酸酶的比酶活达641.29 U/mg,纯化倍数为16.02,收率为46.40%。Cas9核酸酶在25-42°C保温2 h后剩余酶活保持在65%以上,而在45°C保温15 min后全部失活;其在pH 6.0-10.0范围内稳定性较高,剩余酶活大于68%,在pH9.0时稳定性最高;0.5-20.0mmol/L浓度范围内的Mg^2+对该酶有激活作用,10.0 mmol/L的Mg^2+可使该酶酶活力提高约23%;Ba^2+、Co^2+、Ca^2+、Mn^2+、Cu^2+、Fe^2+、Zn^2+对该酶有不同程度的抑制作用,其中0.5 mmol/L的Cu^2+和Fe^2+对Cas9核酸酶有完全抑制作用。【结论】异源表达并纯化出具有较高纯度和较高酶活力的酿脓链球菌Cas9核酸酶,并对其酶学特性进行了初步研究,该结果对CRISPR/Cas9技术的进一步推广和应用有一定的指导意义。

重组胰岛素样生长因子-1的制备

本文建立大肠埃希菌高效表达重组人胰岛素样生长因子-1(recombinant human insulin-like growth factor-1,rhIGF-1)的制备工艺。应用本实验室构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Sp1-IGF-1,对其进行高密度发酵和IPTG 诱导表达,发酵液经双水相萃取获得包涵体,产量为3 g/L;对包涵体进行变性和复性,建立反相HPLC 法监测复性过程,复性正确率可达60%;复性液经过柱色谱纯化和冷冻干燥,样品纯度大于98%,总收率为35%。本工艺得到的rhIGF-1,分子质量与理论值一致,其HPLC 保留时间、肽图和生物活性均与参比制剂一致。

赖脯胰岛素的稀释复性工艺

通过单因素、正交和响应面等试验优化赖脯胰岛素原包涵体的稀释复性条件,结果显示:在胱氨酸12.0 mmol/L、半胱氨酸1.0 mmol/L、山梨醇8.0%、p H 10.0、包涵体蛋白质浓度1.0 mg/ml的条件下,赖脯胰岛素原的复性收率达到65%。赖脯胰岛素原经酶切与分离纯化后,得到了纯度为98.5%的赖脯胰岛素。纯化后的赖脯胰岛素经质谱鉴定、RPHPLC对比分析以及圆二色谱分析,各项指标均与理论值以及参比制剂一致,本研究为其工业化生产打下基础。

重组猪促肾上腺皮质激素在大肠埃希菌中的高效表达与分离纯化

本研究建立了一种以大肠埃希菌作为宿主,表达重组猪促肾上腺皮质激素(pig adrenocorticotropic hormone,pACTH)的新方法。pACTH在N末端与经典猪瘟病毒N末端自切蛋白酶Npro突变体EDDIE融合,然后在大肠埃希菌胞浆中以包涵体形式表达,包涵体约占菌体湿重的36.2%。经过复性后的包涵体可以促使EDDIE自酶切,从而获得pACTH。通过优化复性条件,EDDIE-pACTH蛋白的自切率从25%提高至60%。复性液通过酸沉淀,能够去除杂蛋白,经反相色谱纯化后获得纯度为99.56%的pACTH。

人生长激素突变体B2036在大肠杆菌中的分泌表达及分离纯化

本研究构建了人生长激素突变体B2036(1)分泌表达载体p TAC-stb2036,并在大肠杆菌W3110菌株中表达。通过单因素分析和正交试验优化发酵培养基组成和培养条件,接种量1%,于菌体生长初期(37℃发酵培养3 h)添加终浓度为0.3 mmol/L的IPTG,之后调整温度为25℃,继续发酵培养18 h,1发酵产量较优化前提高了8倍,达到2.8 mg/L。发酵产物经阴离子交换色谱和反相色谱纯化,得到纯度大于97%的目的蛋白,总收率33.2%。

雷珠单抗5 L高密度发酵关键参数的研究

雷珠单抗含有5对二硫键,由于大肠埃希菌的胞质为还原环境,其二硫键不能正确配对折叠,从而形成无生物学活性的包涵体,且包涵体的变性与复性过程十分繁琐和低效。然而,大肠埃希菌的周质空间含有二硫键氧化还原酶,能为二硫键的正确配对和折叠提供合适的氧化环境,使通过信号肽引导分泌至周质空间的雷珠单抗二硫键正确配对和折叠,从而具有良好的生物学活性。本研究构建了周质可溶表达的基因重组大肠埃希菌,在5 L发酵罐的规模上,对高密度发酵过程中β-D-异丙基硫代半乳糖的浓度、补料速度、诱导温度及溶氧等关键参数进行探究,使雷珠单抗的表达量达到(360±4.24)mg/L,且纯化后得到的雷珠单抗具有良好的抗原结合活性。本研究建立的方法能够大幅度提高雷珠单抗的表达量,实现了在大肠埃希菌周质空间的高效表达,可为工业化提供参考。

重组人甲状旁腺激素的生产工艺研究

本研究采用基因重组大肠埃希菌发酵的方法,以可溶形式表达人甲状旁腺激素融合蛋白。菌体经高压破壁和加热沉淀后获得融合蛋白,经Ulp1酶切去除泛素标签后获得目的蛋白粗品,经阳离子交换色谱法和反相色谱法获得纯度为99.2%的目的蛋白。产品经相对分子质量测定、肽图分析和生物活性测定,证明自制甲状旁腺激素的结构和功能与理论值一致。本研究为工业化制备重组人甲状旁腺激素提供了参考。

Sortase A酶突变体的原核表达、纯化及活性测定（英文）

本研究采用pET28a载体对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的转肽酶A(sortase A,SrtA)截短体SrtA?N25以及突变体m5SrtA?N59、m9SrtA?N59进行了原核发酵表达,并通过镍柱亲和色谱、阳离子交换色谱进行蛋白纯化。随后,通过荧光共振能量转移试验比较了3种酶的催化活性,测定了酶反应动力学常数、筛选了最适反应条件,并进一步探究了不同生化试剂对SrtA酶学活性的影响。结果显示,SrtA?N25、m5SrtA?N59、m9SrtA?N59在大肠埃希菌中均能以可溶形式高效表达,且纯化后得到的高纯度SrtA酶均具有生物学活性。相较于SrtA?N25,m5SrtA?N59、m9SrtA?N59活性分别提高了约68、5 544倍,尤其是m9SrtA?N59的催化活性大大提高。m9SrtA?N59的最适反应温度为30~37℃,最适反应pH值为6.0~7.0,反应体系中加入三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)等还原剂有助于增强SrtA酶催化活性。

GLP-1融合蛋白的表达、纯化及其初步活性分析（英文）

PAS融合技术是一项通过PAS融合蛋白来延长生物药体内血清半衰期的新技术。为了验证该技术的可行性,本研究在基因水平上将PAS序列连接在蛋白药物GLP-1序列的两端,并在大肠杆菌中表达。经纯化后,该目的蛋白纯度达到95%,并进行了细胞学活性分析,结果显示融合蛋白PAS化GLP-1的EC50为6.795 nmol/L,略高于阳性对照阿必鲁泰,表明该融合蛋白虽然活性略低于阿必鲁泰,但具有一定的应用前景。综上所述,该技术应用于蛋白药物GLP-1具有良好的可行性,同时为研究延长药物的体内半衰期提供参考。

大肠埃希菌中普卡那肽的重组表达

建立了一种重组表达获得普卡那肽的方法。通过对本实验室构建的重组大肠埃希菌gp55-SUMO-SP304菌株进行高密度发酵和高压匀浆破胞,获得了gp55-SUMO-SP304包涵体,再通过酸切和酶切去除gp55-SUMO-SP304包涵体蛋白的融合标签,采用超滤和反相浓缩获得普卡那肽及其异构体。结果显示,每升gp55-SUMO-SP304菌株发酵液可获得包涵体蛋白33.4 g,去除融合标签后可产生普卡那肽148.47 mg。

“十四五”时期食品安全监管形势与对策

随着我国经济进入高质量发展阶段,食品安全监管也面临着新的更高的要求,如何更好地完成党、国家、人民群众交与市场监督管理局的食品安全监管重担,是我们市管人责无旁贷应该思考的问题。本文总结了国内外食品安全监管的研究现状,剖析了江西省食品安全监管的基本情况、存在问题及主要制约,思考并提出有效应对"十四五"时期食品安全监管复杂多变形势的见解和建议,以期扎实推进全省食品安全监管工作,为保障食品安全作出更大贡献。

新型重组Ulp1的制备工艺研究

类泛素特异性蛋白酶1(Ulp1)是从融合蛋白中移除小分子泛素相关修饰物蛋白(SUMO)标签工艺中的重要工具蛋白酶,在重组多肽和蛋白生产制备中具有广泛应用。Ulp1蛋白易聚集的特性给下游分离纯化工艺带来了诸多挑战。为克服这些问题,本研究设计并重组表达制备了一种S13-Ulp1融合蛋白,以提高Ulp1酶的溶解度,减少聚集,同时降低蛋白等电点,便于采用阴离子交换色谱纯化。通过对发酵、澄清等步骤的工艺参数进行优化,建立了一条发酵表达产量高、纯化工艺简便的S13-Ulp1融合蛋白制备工艺。优化后发酵产量达到了2.34g/L,下游分离纯化总收率为64%,制得的S13-Ulp1蛋白的SDS-PAGE纯度为95%。经酶切试验验证,S13-Ulp1融合蛋白具有与Ulp1相同的特异性,可高效地移除SUMO标签,获得目的多肽。

嗜热S-腺苷甲硫氨酸合成酶的固定化及S-腺苷甲硫氨酸的制备

本研究以固定化酶比活力、酶活力回收率和反应稳定性为指标,比较了氨基树脂和环氧树脂固定S-腺苷甲硫氨酸合成酶的差别。结果显示氨基树脂固定化效果好,固定化酶比活力为(27.91±1.33)U/g,固定化酶活力回收率为(25.78±1.23)%,连续反应稳定性好。优化后固定化酶的反应条件如下:上样体积为20 BV,流速为3 BV/h,盐类型为硫酸钾与硫酸镁,产物S-腺苷甲硫氨酸的摩尔转化率达(61.78±1.91)%。固定化酶反应液经DK-1阳离子交换色谱柱纯化后得到纯度大于98%的S-腺苷甲硫氨酸(SAM),收率为(71.50±1.61)%。