‘圣心’杧果实TPS13基因表达分析及酶功能验证

为了探索‘圣心’杧品种中萜烯合酶基因功能,本研究以‘圣心’杧果肉为实验材料,利用同源克隆技术克隆到一个具有产生萜烯类物质功能的基因,并在原核表达体系中诱导纯化出该基因的蛋白,添加前体物质进行酶促反应后,通过气相色谱质谱联用(GC-MS)上机检测该基因的产物。结果表明,在‘圣心’杧果肉中进行扩增得到一个产生萜烯类物质的基因,命名为TPS13,该基因长度在1692 bp,编码563个氨基酸,通过在线网站预测TPS13属于亲水性,不稳定蛋白,理论等电点(pI)值为5.51,说明该蛋白为酸性蛋白。通过对其结构域预测分析:TPS13蛋白的第52~540位氨基酸区间内包含一个天冬氨酸基序的cd00684结构域,属于Ⅰ类萜烯环化酶超家族。酶活性鉴定表明,该基因无法与底物GPP、FPP和GGPP生成产物,具有催化单萜类底物(NPP)生成产物柠檬烯以及α-松油醇。本试验结果为进一步研究杧果萜类物质提供参考依据。

嘉兰中酪氨酸脱羧酶基因的克隆与表达分析

酪氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.28)是高等植物体中秋水仙碱合成的关键酶。为了探索嘉兰秋水仙碱生物合成途径的关键酶基因及其相关功能,本研究根据嘉兰转录组数据库和NCBI数据库,克隆得到一个酪氨酸脱羧酶关键酶基因(GsTyDC1)的CDS序列,并使用RT-qPCR检测GsTyDC1在嘉兰植株中不同组织的表达水平。通过烟草悬浮细胞对GsTyDC1进行稳定转化,并分析其亚细胞定位的结果。结果显示,GsTyDC1基因的CDS区全长为1 545 bp,编码514个氨基酸,蛋白分子量为56.3 kD。生物信息学分析表明,GsTyDC1与水仙、石蒜和芭蕉等百合科植物已报道的Ty DC基因聚在一类,具有类似于与其他已报道物种TyDC基因相似的保守结构区域,并且没有跨膜结构和信号肽。此外,GsTyDC1基因在嘉兰根中表达量最高,花和茎次之,在叶中表达量最低。亚细胞定位显示Gs TyDC1蛋白定位在细胞质中。本研究为下一步验证GsTyDC1基因的功能活性提供一定的基础,为阐明GsTyDC1基因在嘉兰秋水仙碱生物合成途径中的作用提供参考依据。

杧果果实后熟过程中PME基因家族的鉴定与表达分析

为探明影响杧果(Mangifera indica L.)软化的机理、研究果胶甲酯酶(pectin methylesterase,PME)基因家族在杧果果肉中的功能,本研究对‘红象牙’杧果软化期间果实硬度、可溶性固形物含量、微管结构、PME酶活和PME家族表达量进行测定,并对PME基因家族进行生物信息学分析。结果表明,杧果后熟软化过程中伴随着微管骨架的解聚、果实硬度的下降、可溶性固形物含量的升高以及PME活性的降低。在‘红象牙’杧果基因组中共筛选出51个PME基因,Ⅰ型PME(包含PME和PMEI结构域)基因有24个,Ⅱ型PME(仅含PME结构域)基因有27个。51个PME基因中有22个在后熟期表达,参与果实软化。同时,发现mango030191和mango030421两个基因在后熟期内高表达,可能在抑制果胶降解,抑制果实软化中发挥重要作用。Ⅰ型和Ⅱ型PME基因在系统发育树中占据不同分支,第1~2分支都是Ⅰ型PME基因,第3分支都是Ⅱ型PME基因。Ⅰ型和Ⅱ型PME基因拥有各自的基序、保守结构域、内含子外显子特征。本研究鉴定并提供了杧果PME基因家族成员的基本信息,为阐明杧果后熟过程中PME基因的功能提供理论依据。

‘红象牙’果实MiHPL基因的表达分析及酶活性鉴定

挥发性醛类是水果挥发物质之一,脂氢过氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase,HPL)是植物体内的脂肪酸代谢途径中醛类挥发物质合成下游的关键酶。为探索杧果中挥发性醛的种类及其合成途径进而挖掘相关基因,本研究以‘红象牙’杧果果肉作为实验材料,通过气相色谱质谱联用技术(GC-MS)分析了果实中醛类挥发物,利用同源克隆技术从果实中克隆HPL基因,在原核表达系统中诱导并纯化该酶蛋白,添加前体物质进行酶促反应。结果表明,‘红象牙’果肉中醛的种类和含量较少;从果肉中克隆出一个HPL基因,命名为MiHPL,长1485 bp,编码494个氨基酸,理化性质分析发现Mi HPL属于亲水性蛋白、不稳定蛋白,无跨膜结构,蛋白质分子质量约为54.85 kD;对转录组数据的PFKM值分析显示果实后熟过程表达量下调。生物信息学、系统进化树及原核表达结果表明杧果MiHPL基因可能是属于CYP74B亚族;酶活性鉴定实验表明,该酶具有催化底物13(S)-过氧羟基-(9Z,11E,15Z)-十八碳三烯酸(13-HPOD)、13(S)-氢过氧基-(9Z,11E,15Z)-十八三烯酸(13-HPOT)中第13位的过氧基断裂产生己醛、反-2-己烯醛的活性,属于13-HPL。实验结果为今后进行杧果挥发醛的研究提供参考。

红象牙杧果果实PG基因家族鉴定及基因功能分析

杧果采后的快速软化对其经济价值有不利影响,多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)基因被认为对果实采后软化过程中果胶的降解起主要作用。本研究以红象牙杧果为对象,选取其自然后熟过程中的青熟期与完熟期两个阶段进行转录组测序,并得到转录组数据。据此,我们筛选出红象牙杧果中51个PG基因家族成员,并进行基因功能的分析。结果表明,在红象牙杧果后熟阶段的果肉中表达的基因有23个,且根据其表达量可分为上调、下调和基本不变三种表达模式。对这23个PG家族成员进行生物信息学分析发现,PG家族蛋白无跨膜结构,基因含有4~11个外显子。根据基序结构差异,可将PG基因大致分为两类,一类含有所有PG基因共有基序,另一类含有特有的基序。同时,利用系统发育树可将PG家族成员划分为6个分支,且红象牙杧果在6个分支中都有分布,这说明PG基因在种间具有一定的保守性。这23个基因中,随着杧果后熟过程表达量增加,且表达水平较高的基因mango034432、mango010108、mango029745、mango008398,被认为可能与果胶降解和果实软化高度相关。利用系统发育树进一步分析得知,在杧果成熟过程中高表达基因mango034432和mango029745与大多数已被鉴定为在果实软化中具有功能活性的基因聚在一起。因此,它们最有可能是杧果果实软化中的关键PG基因。本研究为进一步阐明果实软化中杧果PG基因的功能提供了科学依据。