莪术醇诱导人肝癌HepG2细胞衰老及其机制研究

为进一步探讨莪术醇的诱导细胞衰老的机制,该研究采用荧光定量PCR技术对莪术醇处理后细胞中81个细胞衰老相关基因差异表达谱进行分析,结果发现TP53及其下游基因p16Ink4a、p21Waf1/Cip1和p27Kip1等的表达水平显著升高,伴随ABL1、ALDH1A3、CHEK2、HRAS、PTEN等多个衰老信号通路启动与效应关联基因的转录显著增强,而CyclinA2、IGFBP3、SIRT1以及TERT等细胞周期进程与衰老信号通路的负性调控基因的表达水平则显著降低。Western印迹检测结果显示,p53及其下游周期素依赖性蛋白激酶抑制物(CKI)分子p21WAF1和p16INK4水平升高,CyclinA2水平降低,与PCR结果一致,并伴野生型p53-诱导的蛋白磷酸酶1(Wip1)水平显著增高,提示莪术醇可能通过激活p53信号通路诱导HepG2细胞衰老。该研究进一步发现莪术醇能够诱导HepG2细胞发生衰老表型改变,伴G0/G1期周期阻滞。

维生素C对A549细胞增殖、凋亡及Caspase-3、Survivin表达的影响

背景与目的维生素C作为一种抗氧化剂,对多种肿瘤均有抑制作用,本研究旨在探讨维生素C对肺癌细胞株A549的增殖、凋亡的影响及其诱导A549细胞凋亡的可能机制。方法在体外培养的肺癌A549细胞株中加入不同浓度的维生素C,采用细胞生长曲线及克隆形成实验检测细胞生长情况;用流式细胞仪检测细胞周期的影响及凋亡率;用RT-PCR方法检测肺癌细胞株A549中Caspase-3、Survivin的表达差异。结果400μg/mL、4mg/mL浓度组维生素C明显抑制A549细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞被阻止在G0/G1期及S期,且随着时间的延长细胞凋亡逐渐增多,RT-PCR检测维生素C可以上调Caspase-3mRNA的表达,并且随着时间的延长Caspase-3mRNA的表达逐渐增强,对Survivin mRNA的表达无确切作用。结论维生素C呈时间和剂量依赖性抑制A549细胞的增殖,并使A549细胞阻止在G0/G1期及S期,并呈时间依赖性诱导A549细胞凋亡,其机制可能是通过上调Caspase-3的表达。

EGCG对鼻咽癌CNE-2细胞增殖、凋亡及survivin、VEGF表达的影响

目的:探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对鼻咽癌细胞增殖、凋亡及生存素(survivin)和血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法:体外培养鼻咽癌细胞,以不同质量浓度EGCG处理,采用MTT法检测细胞增殖抑制作用,Hoechst33258染色观察凋亡细胞并计算细胞凋亡率,流式细胞仪检测细胞周期变化,RT-PCR检测survivin和VEGF的表达变化。结果:EGCG处理后,CNE-2细胞增殖明显受到抑制,呈时间和剂量依赖性;CNE-2细胞凋亡率显著升高;CNE-2细胞周期阻滞于G1/G0,表现为浓度依赖性;survivin和VEGF的表达明显下调,随EGCG浓度的增加有下降趋势。结论:EGCG能抑制鼻咽癌细胞增殖、促进其凋亡;机制可能与EGCG下调survivn和VEGF的表达有关。

PDGF-α受体反义寡核苷酸对体外视网膜色素上皮细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨血小板源性生长因子-α受体反义寡核苷酸(PDGFR-αASODN)对体外人视网膜色素上皮(humanretinal pigment epithelium,HRPE)细胞增殖和凋亡的作用。方法:使用阳离子脂质体lipofectamineTM2000将靶向PDGFR-α基因的ASODN转染至细胞株HRPE细胞,MTT法检测对HRPE细胞增殖的影响;Hoechst33258荧光染色观察凋亡细胞;流式细胞仪检测HRPE细胞的周期和凋亡率。结果:PDGFR-αASODN转染组细胞增殖抑制率和凋亡率均明显高于对照组(P<0.05)。结论:沉默PDGFR-α基因表达可显著抑制HRPE细胞的增殖,并能诱导其凋亡。

青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞系HFL-I细胞增殖、凋亡的影响及机制

目的进一步探讨青蒿琥酯的抗纤维化作用及机制。方法取对数生长期人胚肺成纤维细胞（HELF）系HFL-I细胞株，随机分为观察1—4组及对照组，观察1-4组分别加入质量浓度为4、8、16、32mg／L的青蒿琥酯，对照组加入等体积培养液后继续培养。用CCK-8法检测细胞增殖情况（A值），流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率，RT-PCR法测定Survivin mRNA表达。结果观察1-4组G0＋G1期细胞所占比例及细胞凋亡率均显著高于对照组，细胞A值及Survivin mRNA表达均显著低于对照组，且各观察组间亦有显著差异（P〈0．05）。结论青蒿琥酯具有抗肺纤维化作用，可能机制为通过下调Survivin mRNA表达抑制HFL-I细胞增殖、促进HFL-I细胞凋亡。

SiRNA-Survivin增强鼻咽癌细胞对放射敏感性的实验研究

目的研究Survivin表达抑制对鼻咽癌放射敏感性的影响,探讨Survivin基因为靶的分子干预在鼻咽癌放疗中作用。方法采用脂质体将Survivin特异性siRNA转染鼻咽癌5-8F细胞系,半定量RT-PCR、流式细胞仪检测Survivin基因表达;Survivin特异性siRNA转染5-8F细胞,培养24h后,用6GY的放射线处理细胞,继续培养24h后,收集细胞。流式细胞仪、镜下计数检测细胞增殖、凋亡与细胞周期。结果Survivin特异性的siRNA能有效地阻断5-8F细胞系中Survivin基因表达。特异性SiRNA加放射组,细胞抑制率(33.7±1.5%)显著高于特异性SiRNA组([23.8±4.3)%,(P<0.05)]和随机序列的siRNA加放射组([15.5±1.7)%,(P<0.01)]。特异性SiRNA加放射组,细胞凋亡率(24.67±0.50)显著高于特异性SiRNA组([20.30±0.44),(P<0.05)]和随机序列的siRNA加放射组([6.58±0.38),(P<0.01)]。特异性siRNA加放射组,S/G1比率(2.76±0.186)显著高于特异性siRNA组([1.91±0.067),(P<0.01)]与随机序列的siRNA加放射组([0.585±0.066),(P<0.01)]。结论有效干预Survivin基因表达能提高鼻咽癌细胞的放射敏感性,增强鼻咽癌的放疗效果。

EGCG诱导前列腺癌细胞PC-3凋亡及对Survivin蛋白表达的影响

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocat-echin-3-gallate,EGCG)对人前列腺癌细胞PC-3凋亡及对其Survivin蛋白表达的影响。方法使用不同浓度的EGCG(0、20、40、80μg/mL)处理前列腺癌细胞株PC-3,通过细胞增殖曲线实验检测EGCG对PC-3细胞增殖的影响;流式细胞仪检测不同浓度EGCG处理PC-3细胞48h后对细胞周期及凋亡的影响;用RT-PCR法检测各浓度EGCG作用48h后PC-3细胞中Survivin基因的表达差异,使用Western blot进行确认。结果 EGCG可以抑制PC-3细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用随EGCG浓度的增加而增强(P<0.05);Sur-vivin在PC-3细胞中高表达,EGCG促使PC-3细胞的Survivin表达下调,其表达水平随EGCG浓度的增加而减少(P<0.01)。结论 EGCG能下调PC-3细胞中Survivin蛋白的表达,这可能是EGCG抑制PC-3细胞增殖、诱导其凋亡的关键机制。

EGCG对鼻咽癌CNE-2裸鼠移植瘤放疗的增敏作用及机制

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对鼻咽癌裸鼠移植瘤放疗的增敏作用及可能机制。方法将低分化鼻咽癌CNE-2细胞株接种于20只4～6周龄雄性BALA/C裸鼠皮下,肿瘤长至4～6mm时随机分为对照组、EGCG组、放疗组、EGCG+放疗组。分别采用生理盐水、EGCG、放疗、EGCG+放疗等干预。21天取出肿瘤,计算肿瘤抑制率;HE染色观察肿瘤细胞形态变化;RT-PCR检测瘤组织Caspase-3mRNA表达。结果与对照组相比,其他三组肿瘤抑制率均明显升高,EGCG+放疗组显著高于EGCG组及放疗组(P<0.05);对照组肿瘤细胞生长旺盛,EGCG组、放疗组、EGCG+放疗组可见大量凋亡及坏死细胞,其中以EGCG联合放疗组最明显。Caspase-3mRNA表达均明显升高,而以EGCG+放疗组最为明显(P<0.05)。结论 EGCG能增强鼻咽癌CNE-2裸鼠移植瘤对放疗的敏感性,其机制可能与上调Caspase-3mRNA的表达有关。

Survivin表达抑制影响鼻咽癌细胞的增殖与凋亡

目的研究Survivin表达抑制对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响,探讨Survivin在鼻咽癌中的生物学功能。方法采用脂质体将Survivin特异性SiRNA(small interfering RNA)转入鼻咽癌细胞株5-8F,培养48h后,收集细胞。逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、流式细胞仪(flow cytometry,FCM)分别检测Survivin mRNA和蛋白在细胞中表达。流式细胞仪检测细胞凋亡与周期,显微镜下计数检测细胞增殖抑制。结果SiRNA抑制5-8F细胞Survivin表达后,细胞凋亡指数显著高于对照组(P<0.01);S/G1比值显著高于对照组(P<0.01);细胞增殖抑制率也显著高于对照组(P<0.01);脂质体对照组与阴性SiRNA对照组比较,细胞凋亡、周期和增殖差异无显著性(P>0.05)。结论Survivin表达抑制,诱导鼻咽癌细胞凋亡并抑制其增殖。

青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞系HFL-Ⅰ细胞胶原合成的影响及机制

目的进一步探讨青蒿琥酯对肺纤维化的治疗作用及机制。方法取对数生长期的人胚肺成纤维细胞(HELF)系HFL-Ⅰ细胞,随机分为观察1～3组及对照组,观察1～3组分别加入质量浓度为1、10、100 mg/L的青蒿琥酯,对照组加入等体积培养液继续培养。用天狼猩红染色法检测胶原蛋白的分泌水平,RT-PCR法测定Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白mRNA的表达。结果观察1～3组胶原表达量、Ⅰ型、Ⅲ型前胶原蛋白mRNA表达均显著低于对照组,且各观察组间两两比较有显著差异(P均<0.05)。结论青蒿琥酯具有抗纤维化的作用,可在一定程度上降低胶原分泌,其机制可能为下调Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白mRNA表达。

青蒿琥酯诱导人胚肺成纤维细胞凋亡的分子机制研究

目的研究青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞(HELF)系HFL-I细胞株体外生长的影响,为青蒿琥酯抗纤维化提供实验依据。方法采用CCK-8法检测青蒿琥酯对体外培养的HFL-I细胞的生长抑制作用,用流式细胞术测定细胞凋亡率;RT-PCR法测定Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达。结果青蒿琥酯呈浓度依赖性抑制HFL-I细胞增殖,HFL-I细胞经青蒿琥酯作用后凋亡率明显增加(P<0.01),Bcl-2 mRNA的表达显著低于对照组,Bax mRNA的表达显著高于对照组。结论青蒿琥酯具有抗肺纤维化作用,可能机制为通过下调Bcl-2 mRNA和上调Bax mRNA表达抑制HFL-I细胞增殖,促进HFL-I细胞凋亡。

EGCG对鼻咽癌细胞增殖抑制和凋亡诱导时NF-κB和caspase-3的表达变化

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)作用于鼻咽癌CNE-2细胞后,对转录因子NF-κB和凋亡效应酶caspase-3表达的影响,以及这两个基因的表达与鼻咽癌细胞凋亡和增殖的关联性。方法体外培养鼻咽癌细胞CNE-2,MTT法检测细胞增殖的抑制作用;Hoechst染色检测细胞凋亡;流式细胞仪分析细胞周期的改变。RT-PCR检测NF-κB和caspase-3的表达。结果EGCG能明显的抑制鼻咽癌细胞增殖,诱导其凋亡,并表现为浓度依赖性:流式分析显示,EGCG干预鼻咽癌细胞CNE-2在48小时后,细胞被阻滞于G1期。80mg/L EGCG处理鼻咽癌细胞24小时和48小时后,均能下调NF-κB表达,上调caspase-3表达。结论EGCG可能通过抑制NF-κB和诱导caspase-3的表达来发挥其抗鼻咽癌细胞的生物学作用。

葛根素预处理对大鼠脑缺血早期脑组织eNOS的影响

目的:研究葛根素在脑缺血早期的脑保护作用是否与脑组织内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达有关。方法:45只大鼠随机分为3个研究组:假手术组(S组)5只、脑缺血组(M组)20只和葛根素预处理组(P组)20只。其中,P组和M组又分别分为脑缺血0.5 h、1 h、2 h、4 h 4个亚组。除假手术组外其它大鼠制作大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,P组在手术前10 min腹腔注射葛根素(100 mg/kg),M组和S组在同样时点注射等量生理盐水。采用神经功能缺损评分、神经元尼氏体染色评价脑组织功能及形态变化;采用免疫组化和Western blotting方法检测脑组织eNOS,观察其分布和表达水平。结果:P组各亚组神经功能缺损评分较对应时点的M组减轻(P<0.05),神经元尼氏体溶解也较M组减少,其脑组织eNOS蛋白质的表达均明显高于对应时点的M组(P<0.05)。结论:葛根素预处理对大鼠脑缺血早期的脑保护机制可能与其上调脑组织eNOS蛋白质表达有关。

罗汉果皂甙类成分代谢转化规律分析

目的:分析组织培养苗罗汉果皂甙类成分在果实成熟过程中的代谢转化规律,为罗汉果甜甙代谢关键酶的研究提供基础。方法:采用微波炉水煮法提取不同生长期罗汉果总甙,高相液相色谱(HPLC)分析各生长期罗汉果二糖甙(甙Ⅱ)、三糖甙(甙Ⅲ)和五糖甙(甙Ⅴ)的含量。结果:果龄10d的罗汉果中,能检测到甙Ⅱ(3 666.4μg/100mg)及甙Ⅲ(48.4μg/100mg),甙Ⅴ检测不到;果龄50d时,能检测到甙Ⅴ(95.1μg/100mg)和高含量的甙Ⅲ(1 213.8μg/100mg);随着果龄增长和果实逐渐成熟,低糖苦甙Ⅱ、甙Ⅲ含量逐渐减少,高糖甜甙Ⅴ含量逐渐升高。果龄70d时,苦甙Ⅱ、甙Ⅲ基本检测不到,而甜甙Ⅴ(1 331.4μg/100mg)含量达到高水平。结论:罗汉果高糖甜甙可能是从低糖苦甙代谢转化而来。

银杏提取物EGB761对过氧化氢诱导肾小管上皮细胞凋亡的抑制作用研究

目的探讨银杏提取物EGB761对过氧化氢诱导肾小管上皮细胞凋亡的抑制作用及发生机制。方法采用500μmol/L浓度的过氧化氢(H2O2)作用于对数生长期的肾小管上皮细胞(NRK52E),建立细胞氧化损伤模型。银杏提取物EGB761分为高中低3个浓度组进行干预,应用细胞生长曲线检测细胞生长情况,用流式细胞术检测肾小管上皮细胞的凋亡率,RT-PCR检测Caspase-3基因的表达差异。结果与过氧化氢组比较,高、中浓度组银杏提取物EGB761的凋亡阳性率均明显降低,而低浓度组虽有减少趋势但无显著性差异;高、中浓度组银杏提取物EGB761的Caspase-3表达阳性率较过氧化氢组明显降低,且随着浓度的增加而表达逐渐减少(P<0.05)。结论银杏提取物EGB761可以拮抗过氧化氢诱导肾小管上皮细胞凋亡的效应,其机制估计与下调Caspase-3的表达有关。

不同生长期罗汉果蛋白组图谱比较研究

目的:分析、比较30d和60d两个不同时期罗汉果蛋白质组图谱,寻找与罗汉果发育、成熟及罗汉果甜甙生成密切相关基因,为罗汉果的开发和品种改良提供基础。方法:采用双向电泳(2-DE)技术构建30d和60d罗汉果蛋白质组图谱,应用Im-ageMaster 2D图像分析软件对所得蛋白质组图谱进行分析。结果:30d和60d两个不同时期罗汉果蛋白质组图谱有明显差别,与30d罗汉果蛋白组图谱比较,随果实发育、成熟,60d罗汉果有29个新的蛋白产生,30个蛋白消失,16个蛋白表达3倍升高和15个蛋白表达50%下调。结论:罗汉果生长、发育和成熟的不同阶段受特定基因的表达调控。

顺铂诱导人鼻咽癌CNE2细胞衰老及其相关基因表达谱的研究

目的探讨顺铂体外诱导人鼻咽癌CNE2细胞衰老的效应及其分子机制。方法采用MTT比色法观察顺铂对CNE2细胞增殖的抑制作用,衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性评判细胞衰老,流式细胞术分析细胞周期分布,实时定量PCR法检测78个人类细胞衰老相关基因的表达。结果顺铂对CNE2细胞的增殖具有明显抑制作用;1.0 mg/L顺铂处理后第6和第8天检测SA-β-gal染色阳性细胞数分别达到67.63%和89.22%,细胞阻滞于G2期;TP53、TP63、p16Ink4a,p27Kip1、PTEN、RB1、Cdc25C、TBX3、Gadd45a、IGF1R、PIK3CA、BMI-1、B2M、MORC3、MYC和SPARC等16个衰老相关基因的m RNA水平显著升高(P<0.05或0.01),Cyclin A2、Cyclin B1、Cyclin E1、CDK6、ATM、ETS2、MDM2、E2F1、ETS1、FN1、IGFBP3、RBL2、SERPINB2及SIRT1等14个基因表达水平下降(P<0.05或0.01)。结论顺铂能够在体外诱导CNE2细胞衰老,其机制涉及p16和p27介导的p53-p RB和PTEN衰老信号调控网络。

EMMPRIN基因增强CT26小鼠结肠癌细胞的转移潜能

背景与目的:结肠癌的侵袭转移是临床上绝大多数结肠癌患者的致死因素,研究表明,细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN)基因参与了肿瘤的转移过程。为研究EMMPRIN基因在结肠癌侵袭转移过程中的意义,本研究将初步探讨EMMPRIN基因对CT26小鼠结肠癌细胞转移潜能的影响。方法:构建包含EMMPRIN基因编码框的真核表达载体pCMV-HA2-EMMPRIN,通过质脂体转染CT26细胞,经G418筛选,建立稳定表达EMMPRIN基因的CT26细胞株。通过体外侵袭实验、迁移实验、粘附实验分析EMMPRIN在CT26中过表达及CT26细胞在侵袭、迁移、粘附等转移能力上的改变。结果:当EMMPRIN基因在CT26细胞稳定过表达后,侵袭实验的结果为EMMPRIN组:103.33±8.49个细胞,对照组:48.67±5.31个细胞(P<0.01);迁移实验的结果为EMMPRIN组:40.67±2.49个细胞,对照组:18.33±2.05个细胞(P<0.01);粘附实验的CCK-8检测结果为EMMPRIN组:2.10±0.22,对照组:3.33±0.17(P<0.01)。结论:EMMPRIN基因可明显促进小鼠结肠癌细胞CT26的侵袭与迁移,并抑制其粘附,提示EMMPRIN基因对CT26细胞的转移具有促进作用。

杏丁对过氧化氢诱导肾小管上皮细胞凋亡的抑制作用及其机制

目的观察杏丁对过氧化氢(H2O2)诱导肾小管上皮细胞(NRK52E)凋亡的抑制作用及其作用机制。方法将人肾小管上皮细胞分成:对照组,H2O2(400μmol/L),杏丁+H2O2组,杏丁组,各组细胞培养至80%～90%汇合时加入相应药物干预,采用H2O2诱导肾小管上皮细胞凋亡模型,用细胞生长曲线检测细胞生长情况,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,并采用RT-PCR检测Survivin mRNA表达。结果杏丁可以抑制H2O2诱导的细胞凋亡,并降低细胞凋亡率,增加Survivin mRNA表达。结论杏丁显著抑制H2O2诱导的细胞凋亡,其抗细胞凋亡作用可能与其增加Survivin表达活化有关。

RNA干扰抑制PDGF-α受体对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的:探讨针对血小板源性生长因子α受体(PDGFR-α)的RNA干扰(RNAi)对体外培养的人视网膜色素上皮(h RPE)细胞增生的影响。方法:PDGFR-αsh RNA转染h RPE细胞48h后,MTT检测h RPE细胞的增殖,并计算转染物对细胞的抑制率,RT-PCR和Western blot检测h RPE细胞中PDGFR-α基因m RNA和蛋白的表达,流式细胞仪分析h RPE细胞的细胞周期。结果:h RPE细胞增殖明显受到抑制且呈剂量依赖性(P<0.05);PDGFR-α基因m RNA和蛋白的表达明显下调(P<0.05);G1期细胞百分比明显升高。结论:PDGFR-αsh RNA可沉默h RPE细胞中PDGFR-α基因m RNA和蛋白的表达,抑制细胞增殖。