香鱼凝血因子X基因表达与鳗利斯顿氏菌感染的相关性

凝血途径的关键因子--凝血因子X(coagulation factor X,FX),是一种与免疫调控密切相关的维生素K依赖型丝氨酸蛋白酶。该研究克隆了香鱼(Plecoglossus altivelis)FX基因全长cDNA序列,它由1817个核苷酸组成,包含一个大的开放阅读框,编码一个由453个氨基酸组成的相对分子质量为5.07×104的蛋白。香鱼FX与已知的哺乳动物FX的结构相似,N端24个残基为信号肽序列。序列比较表明,香鱼FX与斑马鱼FX的氨基酸同一性最高,为53%。在健康香鱼中,FX基因mRNA主要在肝组织中表达,脑和鳃中也有少量表达。实时荧光定量PCR分析揭示,鳗利斯顿氏菌感染后香鱼肝组织中FX基因mRNA表达显著上调,16h时达到5.43倍。通过原核表达系统表达了香鱼FX丝氨酸蛋白酶结构域,并制备了抗血清。Western blotting分析显示,鳗利斯顿氏菌感染后香鱼血清中FX含量显著增加,并随着时间延长上调倍数不断增大,在36h时达到3.68倍。据此,FX基因mRNA及蛋白的表达与鳗利斯顿氏菌感染香鱼的过程紧密相关,揭示它可能在鱼类抗细菌感染的免疫反应中起重要作用。

香鱼补体成分C9基因的克隆、序列分析及表达

补体成分C9是构成膜攻击复合体引起靶细胞溶解破坏的重要组成成分。该文测定了香鱼C9 （aC9）基因的cDNA全序列, 序列全长2 125个核苷酸, 编码一个由592个氨基酸组成、相对分子质量为6.56×104的前体蛋白, N端22个氨基酸为信号肽序列。序列分析表明, aC9与虹鳟C9的氨基酸同源性最高, 达56.8%, 与其它鱼类C9的同源性介于40.9%~53.8%之间。aC9在健康香鱼肝、脾、肠、鳃和肌肉有表达, 其中在肝内的表达量最高。实时荧光定量PCR的结果显示, 鳗利斯顿氏菌侵染4 h后, 肝中aC9 mRNA表达量显著上调, 并随着时间的推移在16 h时达到峰值。Western blotting分析的结果显示, 鳗利斯顿氏菌侵染后香鱼血清中的aC9蛋白随着时间的推移呈显著上调。以上结果表明, 香鱼肝组织C9基因表达变化与鳗利斯顿氏菌的侵染密切相关,

宁波市高校校园植物现状调查与评价

在对宁波市4所高校校园植物种质资源进行全面调查的基础上,分析了绿化植物的种类、数量、应用频率、植物物种丰富度等,结果表明:这些高校校园共有207种植物,隶属于90科199属,其中乔木45种,占22%;灌木45种,占22%;藤本13种,占6%;草本104种,占50%.人工栽培的绿化植物111种,占植物总数的54%;而杂草有87种,占42%,比例较大,其中葎草(Humulus scandens)、加拿大一枝黄花(Solidago canadensis)、牛筋草(Eleusine indica)对其他植物和校园景观产生了严重影响.校园植物资源丰富度指数为16.86.整体上校园的植物资源较丰富,但绿化结构简单,乔木和草本绿化植物种类较少,校园树种组成类同者较多,种类单一.建议加大植物种类的引种,提高植物种类的丰富度,使校园绿化体系发挥更好的生态效益和景观效果.

陆封型和洄游型香鱼体肾组织的蛋白质组学分析

香鱼(Plecoglossus altivelis)是典型的降海洄游鱼类,由于地理原因,一些香鱼在繁殖季无法回到海中产卵,形成陆封型香鱼。陆封型和洄游型香鱼相比,其体型明显偏小。鱼类的体肾组织可以调控渗透压,从而影响生长,因此我们采用蛋白质组学的方法研究陆封型和洄游型香鱼体肾组织蛋白质组的差异。双向电泳(2-DE)分析筛选到25个差异表达蛋白点,质谱分析成功鉴定出21个蛋白。与洄游型香鱼相比,陆封型香鱼体肾组织中NADH脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、α-微管蛋白、热适应相关蛋白65(Wap65)、热休克蛋白60(HSP60)、丙酮酸脱氢酶(E1)、碳酸酐酶、烯醇酶和乳酸脱氢酶表达量较高。同时陆封型香鱼的β-肌动蛋白、铁蛋白、氨基酰化酶、甲硫氨酸腺苷转移酶、过氧化物酶、丙氨酸乙醛酸转移酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶则表达量较低。它们主要参与能量代谢、应激反应、氨基酸代谢等过程。由于Wap65、HSP60和E1 3种蛋白在蛋白质组学结果中表达改变,且与应激和能量代谢有关,可能影响鱼类生长,因此采用荧光定量PCR(RT-PCR)验证陆封型和洄游型香鱼体肾Wap65、HSP60和E1基因mRNA表达差异,结果表明这3个基因mRNA表达均在陆封型香鱼体肾中较高,与蛋白质组学结果一致。综上,陆封型香鱼的几个糖酵解相关酶和应激蛋白表达量比洄游型香鱼高,而蛋白代谢相关酶表达量较低,揭示陆封型和洄游型香鱼在环境应激和能量代谢等层面有明显的差异。

肝硬化大鼠肝缺血-再灌注损伤后Bsep、Mrp2表达在胆汁淤积中的作用研究

目的研究肝硬化大鼠肝缺血-再灌注损伤(HIRI)后胆汁淤积的部分分子机制。方法将健康SD大鼠随机分成A、B、C 3组,每组15只,建立肝硬化、HIRI模型。A组为正常大鼠HIRI组,B组为肝硬化大鼠假手术组,C组为肝硬化大鼠HIRI组。每组大鼠肝门阻断时间为30min。分别检测各组大鼠术后第1、3、5天的胆汁DBil、TBil含量,血清AST、ALT、TBil、DBil含量;Western blot分析各组大鼠术后第1、3、5天胆盐输出泵(Bsep)、多耐药相关蛋白2(Mrp2)表达变化;免疫组织化学法分析Bsep蛋白的细胞亚定位。结果术后第1天,C组大鼠胆汁TBil、DBil含量均低于A组(均P<0.05);术后第3天,C组大鼠胆汁TBil、DBil含量均低于A组和B组(均P<0.05);术后第5天,3组大鼠胆汁TBil、DBil含量比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。C组大鼠术后第1、3天血清AST、ALT水平均高于A组,术后第1、3、5天血清TBil、DBil含量均高于A、B组(均P<0.05)。术后第1、3、5天,C组大鼠Bsep蛋白表达量均低于A组,术后第3、5天均低于B组(均P<0.05);C组Mrp2表达均低于A、B组(均P<0.05)。肝细胞Bsep蛋白明显向细胞质移位。结论与正常肝脏相比,硬化肝对缺血耐受能力差,HIRI后硬化肝的胆汁淤积情况更加严重。Bsep、Mrp2表达降低以及Bsep蛋白由细胞膜向细胞质移位的改变在硬化肝HIRI后胆汁淤积中起了重要作用。

汉麻织物对铜绿假单胞菌抑菌作用的研究

目的探讨汉麻织物对铜绿假单胞菌敏感菌株和耐药菌株的抑菌效果。方法采用振荡法研究50%汉麻(B)和100%汉麻(C)对铜绿假单胞菌敏感菌株和耐药菌株的抑菌作用。结果汉麻织物对铜绿假单胞菌有一定的抑菌效果,且抑菌效果随着洗涤次数增加而不断降低。0、10和20次洗涤的B对敏感菌株和耐药菌株的抑菌率分别为30%和30%、0和4%、0和0,而C对敏感菌株和耐药菌株的抑菌率分别为51%和51%、19%和37%、4%和24%。讨论汉麻织物在医院医疗环境中抵抗耐药菌传播方面有重要的潜价值。

1例遗传性异常纤维蛋白原血症的鉴定及分子发病机制研究

目的对1例遗传性异常纤维蛋白原血症家系进行表型、基因型分析,并研究其致病机制。方法采集先证者及其父母的外周血并进行常规出凝血、血浆纤维蛋白原(Fib)活性和抗原检测。对Fib的基因FGA、FGB和FGG的所有外显子及其侧翼序列进行PCR扩增及测序。采用Fib凝固率测定、纤维蛋白聚集曲线和电镜扫描纤维蛋白凝块等方法研究其致病机制。结果先证者活化部分凝血酶原时间、凝血酶原时间正常,凝血酶时间延长,Fib抗原正常、活性降低;其父亲表型与之相似。先证者及其父亲FGA基因第2外显子均存在A1211G杂合碱基置换,导致Fibα链Arg19Gly错义突变。western-blot检测显示,先证者及其父亲血浆Fib无异常条带出现。先证者血浆Fib凝固率为20.8%,凝血酶或爬虫酶诱导的聚集曲线严重受损,纤维蛋白凝块的纤丝直径大于健康人对照(P<0.001),密度小于健康人对照。结论鉴定该病例为遗传性异常纤维蛋白原血症,Fibα链Arg19Gly杂合错义突变导致Fib功能受损,为该病例及相应临床症状的原因。

敲低Sirt7通过CDK2/Rb调控细胞周期抑制结肠癌细胞增殖

探究Sirt7在结肠癌发生发展中的作用,并探讨其具体分子机制。方法:HCT116和HT-29细胞敲低Sirt7,使用qPCR及Western blot分析敲低效率;RTCA分析细胞增殖能力;流式检测细胞周期;Western blot检测调控周期的相关蛋白。结果:敲低Sirt7后,细胞的增殖能力减弱,周期被阻滞于S期。Western blot检测发现CDK2和Rb的蛋白水平显著下降。结论:敲低Sirt7能通过下调CDK2/Rb使细胞周期阻滞于S期,从而抑制细胞增殖。

耐药基因与管家基因的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌亲缘关系研究

目的探讨耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药基因及可移动遗传元件遗传标记的携带情况及菌株之间的亲缘关系。方法收集2013年1-12月医院住院患者中分离到的20株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌,用gyrA与parC基因测序确认菌种,再采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析56种获得性耐药基因、12种MGEs标记、膜孔蛋白基因(ompK35、ompK36)以及喹诺酮类作用靶位基因(gyrA、parC),最后对检测结果作样本聚类分析。结果 20株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌共检出6种β-内酰胺类药物获得性耐药基因、2种膜孔蛋白基因、5种氨基糖苷类药物获得性耐药基因、2种喹诺酮类药物作用靶位基因、1种喹诺酮类药物获得性耐药基因、8种可移动遗传元件标记;样本聚类分析提示,10号为孤立株,其余19株呈明显的聚集性(A家族);A家族可分为A1和A2;A1又可分为A1-1和A1-2;A1-1再可分为A1-1-1和A1-1-2小家族;A1-1-1和A1-1-2小家族聚集性更为明显,并分别出现克隆播散。结论获得性耐药基因与管家基因检测结果提供了本组菌株耐药的遗传基础,并且与耐药表型相对应,样本聚类分析是监控医院感染实用手段。

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药元件分析研究

目的探讨一组耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌获得性耐药基因及可移动遗传元件遗传标记的携带情况及关联性。方法收集2013年1-12月宁波市第二医院住院患者中分离到的20株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌,用gyrA与parC测序确认菌种,再采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类共56种获得性耐药相关基因和12种可移动遗传元件遗传标记,最后对检测结果作指标聚类分析。结果 20株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌每株均检出获得性耐药基因与可移动遗传元件标记,20株菌共检出6种β-内酰胺类获得性耐药基因、4种氨基糖苷类获得性耐药基因、1种16SrRNA甲基化酶基因、8种可移动遗传元件遗传标记,指标聚类分析提示bla KPC与ISKpn6相强关联,bla OXA-1与tnp513相强关联,17株bla KPC-2阳性菌bla KPC-ISKpn6连锁检测均为阳性。结论肺炎克雷伯菌中携带的耐药基因和耐药表表型相对应,携带bla KPC-2和bla IMP-4是该组菌耐碳青霉烯类的重要原因。

血液基因组DNA提取的新方法及其检测意义

目的从血液中分离基因组DNA是临床诊断和基因组研究的基础,血液中的众多指标检测对于很多疾病的早期诊断、预后判断、复发监测及疗效评估都有重要的临床意义。因此需要改善血液基因组DNA提取方法,提高实验效率。方法本方法以tween-20结合盐酸胍的方法释放DNA,无需蛋白酶K消化,通过自制滤膜吸附柱,可以在15 min内得到高纯度的DNA,对冻存及各种抗凝剂处理的血液样本均适用。结果 200μl的血液可以获得6μg左右的基因组DNA,A260/A280>1.8,浓度为30 ng/μl,高于一般商业化试剂盒的血液基因组DNA提取浓度(10 ng/μl)。PCR结果表明产物无抑制剂残留。结论该方法不仅能大大缩短DNA提取操作时间,适用于自动化提取操作,还能节约费用,可广泛使用与临床分子诊断和科研。

光动力疗法联合NS-398抑制Bcl-2促进QBC939细胞凋亡的机制研究

目的研究光动力疗法(PDT)和选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂NS-398联合对人胆管癌细胞QBC939凋亡的影响及其机理。方法 QBC939细胞体外培养后分组:光动力组、NS-398组、联合实验组和空白对照组,分别将0、2、4、6、8、10μg/mL浓度的血卟啉衍生物(HPD)在0、5、10、15 J/cm2的光照强度和0、25、50、100、200μmol/L浓度的NS-398联合作用于QBC939细胞;采用细胞增殖实验(CCK8)检测生长抑制率(R);流式细胞法检测细胞凋亡;荧光定量RT-PCR检测Bcl-2基因表达;免疫细胞化学测定细胞浆中Bcl-2表达;ELISA测定细胞上清中Bcl-2蛋白。结果 PDT和NS-398在体外均能抑制QBC939细胞生长,当HPD浓度8μg/mL,光照强度5 J/cm2联合50μmol/L的NS-398,R值约达95%,联合实验组与其他3组比较均有统计学差异(P<0.05),继续增加2种强度,R变化不明显;流式细胞法表明PDT和NS-398联合能促进QBC939细胞早期凋亡(F=3 224.753,P<0.001)。荧光定量RT-PCR显示联合能抑制细胞中Bcl-2表达(F=6 262.227,P<0.001);SP免疫细胞化学显示联合能抑制细胞浆中Bcl-2表达(F=1 355.577,P<0.001);ELISA显示联合能抑制细胞上清中Bcl-2分泌(F=5 123.387,P<0.001)。结论 PDT和NS-398联合可明显抑制QBC939细胞生长,诱导早期凋亡,对生长的抑制可能是通过抑制Bcl-2基因和蛋白的表达,促进其早期凋亡实现的。