线粒体DNA诱导肺泡巨噬细胞炎症反应的实验研究

目的观察线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)刺激肺泡巨噬细胞后炎症因子的动态变化,探讨mtDNA对肺泡巨噬细胞的致炎效应。方法取SD大鼠肝脏组织用改良的碱变性法进行mtDNA的提取、纯化。将体外培养的大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)分为mtDNA组(5μg·mL-1,A组),mtDNA组(10μg·mL-1,B组),空白对照组(C组),分别在A、B组中加入mtDNA 5μg·mL-1、10μg·mL-1,在0、3、6、12和24 h时相点收集各组细胞培养上清液,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和IL-6的表达水平。结果 A组和B组在3、6、12和24 h TNF-α、IL-1β和IL-6的表达量显著高于C组(P<0.01),且在3、6、12和24 h时B组的表达量高于A组(P<0.05)。结论 mtDNA能够诱导肺泡巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的表达,且呈剂量依赖性,推测mtDNA具有促炎作用。

脓毒症患者血浆miR-146a的表达及早期诊断

目的研究脓毒症患者血浆中miR-146a的表达,评价其对脓毒症早期诊断的价值。方法采集脓毒症患者(脓毒症组,30例)及同期进行体检的健康人员(健康对照组,20例)的血标本。采用实时荧光定量PCR(RTqPCR)检测血浆miR-146a水平;检测降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)水平,并记录APACHEⅡ评分。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价血浆miR-146a、PCT、CRP对脓毒症的预测价值;分析miR-146a的表达与PCT、CRP及APACHEⅡ评分的相关性。结果脓毒症组miR-146a的表达倍数明显高于健康对照组[(7.03±3.17)比(2.39±1.47),P<0.05],PCT及CRP含量、APACHEⅡ评分亦高于健康对照组(均P<0.05);且miR-146a与PCT、CRP及APACHEⅡ评分呈正相关(r分别为0.767、0.797、0.672)。miR-146a诊断脓毒症的敏感性和特异性分别为86.67%、45.00%,ROC曲线下面积(AUC)为0.898。结论血浆miR-146a对脓毒症的早期诊断指标具有较高的敏感性及特异性。

胞浆内线粒体DNA在脂多糖诱导肺泡巨噬细胞炎症反应时的变化

目的观察胞浆内线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的NR8383肺泡巨噬细胞炎症反应时的动态变化,以初步探讨胞浆内mtDNA在肺泡巨噬细胞炎症反应中的作用。方法将体外培养的大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)用终浓度为1μg·mL-1的LPS刺激0、3、6、12和24 h后收集细胞培养上清液及细胞,采用差速离心法分离胞浆中的mtDNA,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测胞浆中mtDNA表达情况,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养上清液中IL-1β蛋白水平。结果 LPS刺激后3、6、12和24 h IL-1β及胞浆中mtDNA的含量均显著高于0 h组(P<0.01)。结论 LPS刺激肺泡巨噬细胞后,胞浆中mtDNA含量升高,推测其可能参与了肺泡巨噬细胞的炎症反应。

乙酰胆碱酯酶在脂多糖诱导肺泡巨噬细胞中的变化

目的 观察脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激大鼠肺泡巨噬细胞NR8383后乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,ACHE）的表达变化,为研究胆碱能抗炎通路的调控提供新的实验依据.方法 将体外去致热源培养的NR8383细胞分为对照组及LPS（1μg/mL）刺激组,于刺激后3、6、12、24 h各时间点分别离心收集上清液及细胞沉淀,采用酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA）测定上清液中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的变化,实时定量PCR检测细胞中AChE mRNA的表达改变,蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测细胞中AChE蛋白的表达变化,乙酰胆碱酯酶T-CHE测试盒检测上清液中AChE活性的变化.组间多重比较采用单因素方差分析,进一步采用LSD-t检验进行两两比较,P＜0.05为差异具有统计学意义.结果 与对照组相比,TNF-α的含量在LPS刺激NR8383细胞后3h开始显著上升（P＜0.05）,12 h达高峰,24 h下降但仍明显高于对照组水平（P＜0.05）.与对照组相比,AChE mRNA于刺激后3h开始上升,升高（3.19±0.44）倍（P＜0.05）,6h后达高水平并维持于此水平,6、12、24 h分别上调[（5.65±0.63）、（5.40±0.71）、（5.35±0.77）[倍（与对照组相比,均P＜0.05）;AChE蛋白的表达及上清液中AChE的活性在LPS刺激后12 h与各自对照组相比均上升[AChE蛋白：（1.37±0.01） vs.（1.05±0.02）,P＜0.05; AChE活性：（6.14±1.13） U/mLvs.（2.64±0.85） U/mL,P＜0.05],随后呈下降趋势,于LPS作用24 h时均低于各自对照组[AChE蛋白：0.65±0.05,P＜0.05,AChE活性：（0.56±0.19）U/mL,P＜0.05].结论 LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞后,AChE的表达增加,提示其可能参与肺泡巨噬细胞炎症反应的调控;LPS刺激后24 h,AChE mRNA仍处于高表达水平,AChE蛋白及活性却下降,提示在肺泡巨噬细胞炎症反应中可能存在AChE转录后水平的调控.

微小RNA-146a调控肺泡巨噬细胞中白细胞介素-1受体相关激酶1和肿瘤坏死因子受体相关因子6的表达

目的 观察转染微小RNR-146a（miR-146a）对肺泡巨噬细胞中白细胞介素-1受体相关激酶1（IRAK-1）和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF-6）表达的影响,为探讨miR-146a对肺泡巨噬细胞炎症反应的调控机制奠定基础.方法 将体外培养大鼠肺泡巨噬细胞NR8383分为miR-146a模拟物（mimic）组和阴性对照组,分别加入50 nmol/L Pre-miR miR-146a前体和Cy3标记的Pre-miR阴性对照进行转染,转染24 h后收集细胞,采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）检测细胞中miR-146a、IRAK-1 mRNA、TRAF-6mRNA的表达,采用蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测细胞中IRAK-1和TRAF-6的蛋白表达.结果 miR-146amimic组miR-146a表达较阴性对照组上调了（24.55±6.14）倍（t=-6.643,P=0.003）.细胞中IRAK-1和TRAF-6的mRNA表达分别为阴性对照组的（1.16±0.10）倍（t=2.701,P=0.054）和（1.19±0.16）倍（t=2.032,P=0.112）.而IRAK-1和TRAF-6的蛋白表达分别为阴性对照组的73.0％（t=-9.353,P=0.001）和64.1％（t=-6.839,P=0.002）.结论 miR-146a mimic能成功转染肺泡巨噬细胞NR8383; miR-146a过表达后,能有效下调肺泡巨噬细胞中IRAK-1和TRAF-6的表达,其机制可能是在蛋白翻译水平的抑制.