NADP-异柠檬酸脱氢酶的结构与功能

异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)在三羧酸(TCA)循环中催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸,将NAD+或NADP+还原成NADH或NADPH.根据空间结构特点,NADP-依赖性IDH可分为同源二聚体IDH和单体IDH,它们对生物体的能量代谢、生物合成以及抗氧化胁迫起重要作用.当碳源贫乏时,NADP-依赖性IDH的可逆磷酸化对TCA循环和乙醛酸旁路碳通量(carbon flux)的分配起关键性调控作用.因此目前IDH是研究蛋白质的结构与功能关系、酶的催化与调节机制、蛋白质功能进化的最好模型之一.

吡啶核苷酸转氢酶的结构及功能

吡啶核苷酸转氢酶(pyridine nucleotide transhydrogenases)是能直接催化NADP(H)与NAD(H)之间氢负离子可逆转移的氧化还原酶,主要调控分解代谢和合成代谢过程中NADH与NADPH之间的动态平衡.膜结合吡啶核苷酸转氢酶(TH)是ATP依赖性跨膜蛋白,由2个亚基构成,每个亚基包含dⅠ、dⅡ和dⅢ三个结构域.在TH结合可变催化机制中,氢负离子的转移总是与质子转移相偶联.可溶性吡啶核苷酸转氢酶(STH)是非能量依赖性的黄素蛋白,以可溶性多聚体形式存在.目前认为,很多因活性氧自由基异常增多而引起的线粒体疾病都与TH的活性有关,包括糖尿病、癌症、神经退行性疾病及心血管疾病等.TH分子机制的研究将有助于揭示这些线粒体疾病的致病机理以及为其诊断和基因治疗提供分子依据.STH作用机理的研究及其在辅酶再生系统中的应用,将会推动代谢工程和工业生物催化过程的进一步发展.

变铅青链霉菌异柠檬酸脱氢酶的异源表达及序列分析

通过同源性引物成功扩增和克隆了变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK54的异柠檬酸脱氢酶(isocitratedehydrogenase,IDH)(简称SlIDH)基因icd(GenBank登录号为EU661252)。icd的起始密码子为GTG,GC含量为69.55%,显示了链霉菌基因的高GC含量特征,实现了SlIDH在E.coli中的异源高效表达。0.5 mmol/L的IPTG为最佳诱导条件。SlIDH的分子量约为80 kD。在Mn^(2+)或Mg^(2+)条件下,SlIDH以NADP^+为辅酶时的活性分别为7.94 U/mg及4.00 U/mg,以NAD^+为辅酶时的活性分别为0.58 U/mg及0.27 U/mg,SlIDH更偏爱以NADP^+为辅酶。与不同种属单体IDH的氨基酸序列比对显示,SlIDH与单体IDH的序列一致性均在60%以上。因此本工作首次以实验性证据初步鉴定了SlIDH为NADP-依赖型单体IDH。本工作为进一步探索单体IDH的结构与功能以及单体IDH与同源二聚体IDH的进化关系奠定了基础。

新冠病毒蛋白亚单位疫苗研究进展

当前,新冠病毒(SARS-Cov-2)不断突变、进化,新冠肺炎(COVID-19)疫情正严重威胁着人类健康。疫苗是预防和控制新冠肺炎最有效、最经济的手段。全球科研机构及公司采用不同的技术路线,开展新冠疫苗的研制工作。根据制备技术,新冠疫苗分为灭活病毒疫苗、减毒活疫苗、mRNA疫苗、DNA疫苗、病毒载体疫苗、病毒样颗粒疫苗和蛋白亚单位疫苗。其中,基于细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞体外生产关键病毒蛋白或肽所制备的病毒蛋白亚单位疫苗因其安全性、有效性高,生产、储存及运输成本低而具有广泛的应用前景。目前,全球上市的新冠病毒蛋白亚单位疫苗共计14种。鉴于此,本研究梳理全球上市的新冠病毒蛋白亚单位疫苗研究和发展现状,总结其研发原理及临床效果,以期对新冠病毒蛋白亚单位疫苗研制提供借鉴。

GⅡ.2[P16]型诺如病毒P蛋白的可溶表达、纯化及其抗原特性分析

目的获得可溶表达的GⅡ.2[P16]型诺如病毒(norovirus,NV)P蛋白,并分析其抗原特性。方法通过优化合成GⅡ.2[P16]型NV P蛋白基因并克隆至pET-28a(+)载体上,构建重组质粒GⅡ.2-NV-pET-28a,转化DH5α感受态细胞,通过对表达菌种的优化,使P蛋白以可溶性形式表达。表达的P蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后,采用Western blot法检测纯化蛋白抗原性;体积排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SECHPLC)法检测抗原纯度;ELISA法鉴定抗原抗体结合能力。结果重组BL21 Star(DE3)pLySs工程菌目的蛋白以可溶形式高表达,经亲和层析纯化后,GⅡ.2 P蛋白纯度为95.53%,且抗原性较好。结论用原核表达菌种成功制备了可溶性表达的NV P蛋白,并明确了P蛋白的抗原性,为GⅡ.2[P16]型NV检测试剂盒和重组亚单位疫苗的研制奠定了基础。

GⅡ.21型诺如病毒衣壳蛋白VP1的表达、纯化及鉴定

目的构建含有GⅡ.21型人诺如病毒(human norovirus,HuNoV)衣壳蛋白VP1基因的重组质粒,通过PichiaPink毕赤酵母表达VP1蛋白,并鉴定纯化产物。方法合成NoV GⅡ.21 VP1蛋白基因序列,将其连接至pPink-HC载体,构建重组质粒pPink-HC-GⅡ.21-VP1;经测序鉴定后,电转化毕赤酵母PichiaPink,甲醇诱导目的蛋白表达;采用AKTA pure M150型纯化仪纯化目的蛋白,Western blot法分析其抗原性,SEC-HPLC法检测纯化蛋白出峰时间。结果经测序鉴定,重组质粒pPink-HC-GⅡ.21-VP1构建正确;纯化的目的蛋白VP1纯度在95%以上,能与抗NoV病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)抗体发生反应;测定目的蛋白出峰时间为16.923 min,与NoV VLP理论出峰时间一致。结论成功在毕赤酵母高表达了GⅡ.21衣壳蛋白VP1,并制备了高纯度及良好抗原性的目的蛋白,为多价重组NoV疫苗的研发及规模化生产奠定了基础。