自体外周血干细胞移植治疗非霍奇金淋巴瘤的外周血干细胞动员方案临床分析

本研究比较CEP+G-CSF与CVP+G-CSF动员方案对非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者外周血造血干细胞动员采集及造血恢复的效果。回顾性分析我科收治的57例NHL患者。分组采用CEP+G-CSF与CVP+G-CSF动员方案进行外周血干细胞动员采集,并于预处理结束后回输外周血干细胞,分析动员效果、不良反应及自身移植后造血恢复情况。结果表明:动员期间所有患者外周血白细胞(WBC)计数均降至1.0×109/L以下,血小板(Plt)数降至40×109/L以下。57例患者均采集成功,CEP+G-CSF动员方案组采集单个核细胞(MNC)数和CD34+细胞数明显高于CVP+G-CSF动员方案组(p=0.002和p=0.019)。预处理后所有病例均达到骨髓抑制,CEP+G-CSF和CVP+G-CSF动员方案组WBC数恢复到≥1.0×109/L的平均时间分别为11.4和12.3天(p﹥0.05),Plt数恢复到≥50×109/L的平均时间分别为18.6和19.3天(p﹥0.05)。结论:自体外周血干细胞移植治疗NHL疗效显著,CEP或CVP联合G-CSF方案行外周血干细胞动员均安全有效,临床效果满意,CEP+G-CSF方案动员外周血干细胞效果更好。

人Delta-like1^ext-Fc融合蛋白毕赤酵母表达载体的构建及表达

目的:构建人Delta-like1ext-Fc融合蛋白毕赤酵母表达载体PIC-hDll1ext-Fc,并在毕赤酵母GS115中表达。方法:以pEF-BOSneo-hdll1ext-Fc为模板PCR扩增人Delta-like1胞外段。通过DNA重组构建毕赤酵母表达载体PIC-hDll1ext-Fc。用MD平板筛选重组子,G418筛选高拷贝转化子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE、Western blot分析表达蛋白。结果:hDll1基因的胞外段被有效地扩增。序列分析表明,所构建的含hDll1ext-Fc融合基因的质粒与设计相同,融合蛋白hDll1ext-Fc得到正确表达。结论:成功地扩增了人Delta-like1胞外段,构建了hDll1ext-Fc融合基因的毕赤酵母表达载体PIC-hDll1ext-Fc,并在毕赤酵母中正确表达,为进一步研究奠定了实验基础。

人Delta-like4^(ext)-26-217蛋白原核表达载体的构建及表达

构建人Delta-like4ext-26-217原核表达载体并表达。采用PCR方法扩增hD ll4ext-26-217多核苷酸序列,克隆入pMD18T载体。测序正确后,将其亚克隆入pET32 a(+)原核表达载体,获得pET32 a(+)-hD ll4ext-26-217载体。以该载体转化E.coli菌株BL21,IPTG诱导其表达。采用SDS-PAGE、W estern B lot方法鉴定目的蛋白的表达。结果表明,采用SDS-PAGE,W estern B lot等方法均可检测到目的蛋白TRX/hD ll4ext-26-217,分子量约42.2 KD。主要以包涵体形式大量存在。以上结果为Detla-like4功能的进一步研究奠定了基础。

分析10例成人Ph染色体和/或BCR－ABL阳性混合表型急性白血病的临床及实验室特征

目的 总结成人Ph染色体和/或BCR－ABL阳性混合表型急性白血病(Ph＋MPAL)的临床及实验室特征.方法 对１０例Ph＋MPAL患者临床资料进行回顾性分析.结果 Ph＋MPAL患者检出率为１５??３８％,白细胞计数增高.１０例患者均为髓系和B淋系混合表达.７例患者为CD３４高９例可检测到Ph染色体.１０例患者均有BCR－ABL基因融合.治疗后完全缓解患者有７例.结论 Ph＋MPAL患者多表现为髓系和淋系混合表达,在临床治疗过程中,应兼顾淋系和髓系的联合化疗方案,联合应用造血干细胞移植,以提高临床治疗效果.

儿童急性T淋巴细胞白血病中NOTCH１基因突变的特征及临床意义分析

目的 观察分析儿童急性T淋巴细胞白血病(T－ALL)中NOTCH１基因突变的特征及临床意义.方法 通过对２０１３年１月－２０１５年５月期间我院收治的T－ALL患儿NOTCH１基因的HD区域和PEST区域测序,观察T－ALL患儿NOTCH１基因突变发生率、发生位点、类型,以及突变与疾病的严重程度和短期预后之间的关系.结果 ２５例患儿中有１３例存在NOTCH１基因的突变,突变发生率为５２％.在发生NOTCH１基因突变的１３例患儿中,有７例存在突变点,４例存在插入突变,２例缺失突变,８例基因突变发生于HD－N区域,３例突变发生于HD－C区域,２例发生于PEST区域.１３例NOTCH１基因突变的患儿初诊均有WBC＞１０×１０９/L,无突变的患儿７例WBC＞１０×１０９/L,具有明显差异(P＜０??０５).１３例NOTCH１基因突变的患儿中２例一年内死亡,１１例一年内缓解;１２例无基因突变的患儿中４例一年内复发,其余均缓解,无患儿死亡.结论 儿童T－ALL患者NOTCH１基因突变发生率较高,突变类型及位点呈多样性,存在NOTCH１基因突变的患儿病情比无基因突变患儿更严重.

急性淋巴细胞白血病患者血清乳酸脱氢酶和维生素D水平与其预后的关系

目的探讨急性淋巴细胞白血病(ALL)患者血清乳酸脱氢酶(LDH)和维生素D水平与其预后的关系。方法选取成人初治ALL患者63例为ALL组,行大剂量甲氨蝶呤治疗并随访至少1年。并以同期健康查体志愿者30例为对照组。检测比较两组血清LDH和25-羟维生素D[25(OH)D]水平及同期急性生理和慢性健康评分(APACHEⅡ评分)。统计ALL组随访1年的生存预后。分析ALL患者血清LDH和25(OH)D水平与其APACHEⅡ评分及1年生存率的关系及其预测1年生存预后的价值。结果与对照组比较,ALL组治疗前血清LDH水平和APACHEⅡ评分升高而血清25(OH)D水平则降低(P<0.05)。与治疗前比较,ALL组治疗后3d和治疗后1个月的血清LDH水平和APACHEⅡ评分降低而血清25(OH)D水平则升高(P<0.05)。ALL组1年生存率为80.95%。与ALL组存活患者比较,ALL组死亡患者治疗前后的血清LDH水平和APACHEⅡ评分升高而血清25(OH)D水平则降低(P<0.05)。Spearman无条件相关分析结果显示,ALL患者血清LDH水平与APACHEⅡ评分呈正相关(r=0.868,P<0.05)而与1年生存率呈负相关(r=-0.892,P<0.05),其血清25(OH)D水平与APACHEⅡ评分呈负相关(r=-0.705,P<0.05)而与1年生存率呈正相关(r=0.826,P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,ALL患者治疗前、治疗后3d和治疗后1个月的血清LDH和25(OH)D水平联合预测其1年生存预后的准确性分别为88.89%、95.24%和98.41%。结论 ALL患者血清LDH和25(OH)D水平与病情相关且联合预测患者预后的价值良好,可能作为ALL患者病情和预后评估的参考指标。

Notch信号途径对放疗后骨髓谱系造血重建的影响及其机制

目的探讨Notch信号途径对放疗后骨髓谱系造血重建的影响及其机制。方法通过交配获得骨髓造血细胞特异性敲除Notch信号MxCre^+RBP-J^(flox/flox)的双转基因小鼠(敲除组)和未敲除MxCre^+RBP-J^(flox/+)对照小鼠(未敲除组),给予全身一次性^(60)Co-γ射线电离辐照,观察辐照后第7天两组生存状态、造血重建情况。C57/B6小鼠接受全身一次性^(60)Co-γ射线电离辐照,通过腹腔注射Notch配体重组蛋白D1R或PBS分别建立Notch信号激活小鼠(激活组)和未激活小鼠(未激活组),观察给药第7天重组蛋白D1R的体内活性、两组造血重建情况以及髓系前体细胞周期、增殖信号通路变化。另取C57/B6小鼠随机分为阴性对照组、D1R组、阳性对照组,D1R组和阳性对照组同时接受等剂量^(60)Co-γ射线电离辐照后腹腔注射D1R和PBS,阴性对照组不予处理,停药3个月,观察重组蛋白D1R长期毒性。结果与未敲除组比较,敲除组生存状态更差,骨髓造血干/祖细胞、骨髓和外周血有核细胞及髓系细胞形态正常,但数量明显减少(P均<0.05)。与未激活组比较,激活组骨髓造血细胞Notch信号活化片段ICN1的核表达增多,Notch信号激活,骨髓造血干/祖细胞、骨髓和外周血有核细胞及髓系细胞数均明显高于对照组(P均<0.05),骨髓髓系前体细胞G_0/G_1期比例减少,S期比例增多,PI3K蛋白表达增加(P均<0.01)。停药3个月,D1R组细胞形态、组织构架及造血谱系与阴性对照组无明显差别,但骨髓造血干/祖细胞、骨髓和外周血髓系细胞数明显高于阳性对照组(P均<0.05)。结论 Notch信号途径可正向调控放疗后造血重建,尤其髓系重塑,其机制可能与Notch信号激活髓系前体细胞PI3K增殖信号通路、加快细胞周期进程有关。

Notch信号在造血祖细胞扩增中作用的研究进展

造血祖细胞扩增具有十分重要的临床价值,传统的方法扩增往往导致造血祖细胞的分化。Notch受体和配体在造血系统中广泛存在,活化的Notch信号可抑制造血祖细胞的分化而促进其扩增,提示可以通过Notch信号途径实现对造血祖细胞的扩增。本文就Notch信号通路、Notch信号与造血祖细胞维持、Notch信号与造血祖细胞扩增,Notch信号维持造血祖细胞未分化状况的分子机制,进行了综述。

噬血细胞综合征30例临床分析

目的:探讨噬血细胞综合征(HPS)的临床特点、诊断、治疗以及预后的危险因素。方法:对我院30例HPS患者的病因、临床表现、实验室检查指标、治疗方案及临床转归进行回顾性分析。结果:30例HPS病因以感染最多见(30%),其中EB病毒感染达20%,然而病因不明者也高达56.7%。HPS临床表现为持续高热(100%)、脾肿大(93.3%)、全血细胞减少(83.3%)、乳酸脱氢酶(100%)及血清铁蛋白(100%)升高。肝功能损害(90%)及心肌酶谱(60%)升高也较为常见。30例经治HPS患者30d、100d、1年的生存率分别为36.7%、23.3%、10.0%。其中7例给予包含VP16的化疗方案,30d、100d、1年的生存率分别为85.1%、71.4%、42.9%。结论:HPS可由多种病因所致,EB病毒最为常见,临床表现多样。发热、血清铁蛋白、乳酸脱氢酶升高在诊断中的灵敏度较高。包含VP16的化疗方案是有效的治疗方案。

异基因造血干细胞移植后血浆microRNA的表达与急性移植物抗宿主病的相关性研究

目的:探讨血浆microRNA(miRNA)在异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后发生急性移植物抗宿主病(aGVHD)与未发生a GVHD(non-a GVHD)患者的表达情况。方法:采用实时定量PCR(real-time PCR)的方法检测25例患者allo-HSCT移植前和移植后外周血血浆中miR-423,miR199a-3p,miR-93*和miR-377的表达水平。结果:miR-423,miR199a-3p,miR-93*在a GVHD患者中的表达量较未发生a GVHD的患者高(P<0.05),而miR-377在两组之间表达无统计学差异(P=0.0818)。结论:异基因造血干细胞移植后发生a GVHD患者的血浆中miR-423,miR199a-3p,miR-93*表达增高,这可作为为监测和诊断a GVHD的生物标志物。

融合蛋白hJagged1^(ext)-Fc毕赤酵母表达载体的构建及表达

本研究旨在构建人IgG1 Fc蛋白及融合蛋白hJagged1ext-Fc,并在毕赤酵母GS115中表达。用RT-PCR法从人骨髓细胞中扩增hJagged1基因的胞外段。在测序正确后,将hJagged1基因的胞外段插入构建好的PIC-Fc载体,得到PIC-hJagged1ext-Fc。用MD平板筛选重组子,G418法筛选高拷贝转化子,经甲醇诱导表达后,采用SDS-PAGE分析表达蛋白。结果表明:hJagged1基因的胞外段被有效地扩增。序列分析显示所构建的含phJagged1ext-Fc融合基因的质粒与设计相同,人IgG1 Fc蛋白及融合蛋白hJagged1ext-Fc得到正确表达。结论:成功地构建了hJagged1ext-Fc融合基因的毕赤酵母表达载体,并在毕赤酵母中正确表达,为进一步研究Jagged1在造血干/祖细胞的体外扩增奠定了基础。

弥漫大B细胞淋巴瘤内TNFAIP3、PDE4B对肿瘤细胞凋亡、侵袭的影响

目的:研究弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)内肿瘤坏死因子诱导蛋白3基因(TNFAIP3)、磷酸二酯酶4B(PDE4B)对肿瘤细胞凋亡、侵袭的影响。方法:选择2014年8月~2017年7月期间在广州四二一医院诊断为弥漫大B细胞淋巴瘤的68例患者作为研究的DLBCL组,选择同期因淋巴结肿大在广州四二一医院接受淋巴结穿刺活检且诊断为反应性淋巴结增生的34例患者作为对照组。测定淋巴结组织中TNFAIP3、PDE4B以及凋亡基因、侵袭基因的表达量。结果:DLBCL组病灶组织中TNFAIP3、PTEN、PTPL1、Bax的蛋白表达量显著低于对照组(P<0.05),PDE4B、c-myc、AURKA、AURKB、PLK1、Ets-1、β-catenin、MMP7、MMP9、CD44的蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05);DLBCL病灶组织中PTEN、PTPL1、Bax的蛋白表达与TNFAIP3的蛋白表达量呈正相关,与PDE4B的蛋白表达量呈负相关;c-myc、AURKA、AURKB、PLK1、Ets-1、β-catenin、MMP7、MMP9、CD44的蛋白表达量与TNFAIP3的蛋白表达量呈负相关,与PDE4B的蛋白表达量呈正相关。结论:弥漫大B细胞淋巴瘤内TNFAIP3的低表达以及PDE4B的高表达能够拮抗肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞侵袭。

人Delta-like4^(ext)-93-217原核表达、纯化及蛋白活性检测

目的:原核表达、纯化融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217,并对其活性进行检测.方法:采用PCR方法扩增hDll4ext-93-217多核苷酸序列,克隆入pMD18T载体.测序正确后,将其亚克隆入pET32a(+)原核表达载体,获得pET32a(+)-hDll4ext-93-217载体.以该载体转化E.coli菌株BL21,IPTG诱导其表达.以镍离子螯合柱纯化目的蛋白,采用SDS-PAGE,Western Blot方法鉴定目的蛋白的表达;采用萤光素酶报告基因系统检测目的蛋白活性.结果:通过PCR扩增获得了目的片段hDll4ext-93-217,成功构建了该蛋白的原核表达载体pET32a(+)-hDll4ext-93-217.采用SDS-PAGE,Western Blot等方法均可检测到目的可溶性融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217的表达.融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217在25℃,IPTG终浓度0.5mmol/L条件下诱导表达8h的蛋白表达量最高.以镍离子螯合柱纯化,获得纯化融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217浓度为1.5g/L,其荧光素酶报告基因的刺激活性与空白对照组及TRX组相比较差异具有显著性(P=0.0154,P=0.0227,P<0.05).结论:通过原核表达获得的可溶性融合蛋白TRX/hDll4ext-93-217可活化Notch信号途径.

Abd-Bcr／Abl原核表达载体的构建和表达

构建Bcr/Abl-Abd原核表达载体,并表达、观察对白血病细胞K562的影响。以慢性白血病PGD210质粒为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增出Abd编码区序列,克隆入pMD18t载体,经酶切测序鉴定正确。再通过酶切重组克隆入原核表达载体pET32a,构建pET32a-Abd重组表达质粒,经酶切、测序鉴定,序列、读码框均正确。通过转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达,纯化。结果PCR扩增出特异性的501bp的目的片断,以此构建的重组质粒pET32a-Abd能够在上清中表达约36.6kd的目的蛋白,Western blot鉴定为特异表达。证明成功构建了原核表达载体pET32a-Abd,并表达在上清中,表达蛋白约占菌体总蛋白的6%,纯化后达到74.3%,Western blot检测为特异性表达,为进一步研究该蛋白对慢性白血病细胞的作用奠定了分子基础。

人Delta-like 1蛋白的表达及其对动员外周血CD34^+细胞的扩增作用

构建pET32a(+)-hDll1DSL原核表达载体,表达、纯化hDll1DSL蛋白,观察其对动员外周血CD34+细胞的体外扩增作用。克隆hDll1DSL,构建pET32a(+)-hDll1DSL重组表达载体。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,镍珠亲合层析纯化蛋白。RBP-j报告基因实验及Notch下游分子Hes1检测证实hDll1DSL活性。磁珠分选动员外周血CD34+细胞,加入hDll1DSL或联合SCF、FL、TPO孵育一周,观察体外扩增作用。结果表明:成功克隆hDll1DSL,并构建了pET32a(+)-hDll1DSL重组表达载体。在大肠杆菌BL21成功表达Trx-hDll1DSL融合蛋白,经镍珠亲合层析纯化蛋白,成功获得高纯度的Trx-hDll1DSL融合蛋白。配体活性实验显示,可溶性的Trx-hDll1DSL蛋白可以激活RBP-j报告基因,并且能上调Notch下游分子Hes1的表达,证明其能够激活Notch信号通路。此外,Trx-hDll1DSL融合蛋白与SCF、FL及TPO联用,具有协同刺激CD34+细胞体外扩增的作用。我们成功构建了pET32a(+)-hDll1DSL重组表达载体,表达、纯化了具有生物学活性的Trx-hDll1DSL融合蛋白,具有协同刺激CD34+细胞体外扩增的作用,为造血干/祖细胞体外扩增体系的优化研究奠定了基础。

微移植治疗老年急性髓系白血病的临床效果及对预后的影响

目的分析微移植治疗老年急性髓系白血病(AML)的临床效果及对预后的影响。方法选取在西安高新医院血液科接受治疗的40例AML患者为研究对象,采用随机数表法将患者分为观察组和对照组,各20例。对照组给予常规化疗,观察组在此基础上给予微移植治疗。比较两组治疗效果、治疗前、后血常规检测值,并分析预后,记录术后感染及死亡情况。结果观察组的治疗缓解率高于对照组(P<0.05)。治疗后,两组WBC、PBMC值均降低,PLT值均升高,且观察组优于对照组(P<0.05)。观察组无感染情况且无死亡,对照组因肺部感染和败血症出现死亡2例,组间比较,差异不显著(P>0.05)。结论微移植治疗老年AML的效果较佳,预后好,安全可靠,值得临床推广。

融合蛋白TRX-hJagged1原核表达载体的构建及其在BL21中的表达

本研究旨在构建原核表达载体并原核表达Notch配体Jagged1。构建不同长度但均包含DSL区的原核表达载体pET-hJagged1,将构建重组原核表达载体pET-hJagged1转化大肠杆菌BL21后,予以IPTG诱导,优化诱导条件,使目的蛋白TRX-hJagged1在上清中有较大量表达。诱导工程菌并以镍柱纯化对可溶性的目的蛋白进行纯化。结果表明,成功构建了原核表达载体pET-hJagged1(BglⅡ)、pET-hJagged1(HindⅠ)及pET-hJagged1(StuⅠ),但仅pET-hJagged1(StuⅠ)表达可溶性的TRX-hJagged1。通过镍柱纯化获得了较单一的TRX-Jagged1蛋白,Western Blot证实了其为目的蛋白。结论:成功地构建了原核表达载体pET-hJagged1,并在原核表达系统表达了TRX-Jagged1融合蛋白,为进一步研究Jagged1在淋巴造血系统中的作用奠定了基础。

TIP30基因表达对人多发性骨髓瘤细胞生物学功能的影响

目的研究TIP30基因表达对人多发性骨髓瘤U266细胞增殖、凋亡等生物学功能的影响,以期为多发性骨髓瘤临床防治及药物研制提供新的靶点。方法人多发性骨髓瘤U266细胞中TIP30基因过表达采用腺病毒转染法,使用实时定量PCR和Western blotting验证TIP30过表达的效果,分别采用MTT法、划痕试验检测细胞增殖、迁移情况,流式细胞术分析细胞凋亡,Western blotting分析p53、Bax、Bcl-2蛋白表达。结果 TIP30过表达腺病毒转染后,过表达组中U266细胞TIP30基因m RNA和蛋白表达水平均显著上升。与对照组比较,TIP30过表达后,细胞增殖、体外迁移能力均显著减弱(P<0.05);TIP30过表达后U266细胞凋亡率较对照组显著增大,TIP30过表达促进U266细胞凋亡与上调p53、Bax蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达水平相关。结论 TIP30基因过表达可抑制人多发性骨髓瘤U266细胞增殖活性与体外迁移能力,并促进多发性骨髓瘤细胞凋亡。

8p11骨髓增殖综合征1例并文献回顾

8p11骨髓增殖综合征(8p11 myeloproliferative syndrome,EMS)是一组以白细胞计数明显增高、髓系细胞增生、嗜酸性粒细胞增多、淋巴瘤为特征的临床综合征。分子生物学定义是定位于8号染色体短臂(8p11-12)上的成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1)基因与伙伴基因易位或插入而产生的侵袭性肿瘤。2008年WHO将本病定义为髓系、淋系肿瘤伴有成纤维细胞生长因子受体1异常。目前共发现14种与FGFR1重排相关的伙伴基因,其中最常见的是位于13q11-12上的ZNF198。EMS预后差,患者常在短期内迅速进展为急性髓系白血病,目前只有异基因造血干细胞移植能有效控制该病。现报告我科诊断的1例EMS病例,并就其分子生物学特征、发病机制和治疗等的研究现状进行讨论。

Notch配体的原核表达与纯化及其对四氯化碳损伤后造血的影响

目的:通过原核表达并纯化靶向内皮细胞的小鼠Notch重组配体m D1R蛋白,观察其对四氯化碳损伤后造血的影响。方法:PCR克隆并构建p ET22b(+)-m D1R表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导,镍珠亲合层析纯化,SDS-PAGE确认目的蛋白表达。应用流式细胞术、细胞粘附实验、免疫荧光染色及实时定量RT-PCR检测蛋白的内皮靶向性和Notch激活程度。建立四氯化碳损伤小鼠模型,应用流式细胞术观察m D1R蛋白对造血干细胞(HSC)、髓系和淋系细胞的影响,应用磁珠分选Lin^-Scal-1^+c-Kit^+细胞并分析细胞周期的变化,RT-PCR检测IL-10的表达。结果:成功克隆并构建原核表达载体,获得高纯度且有生物学活性的m D1R重组蛋白。m D1R能激活四氯化碳损伤小鼠造血干/祖细胞的Notch信号途径,内源性扩增HSC和长期HSC达2.96倍和6.18倍,促进了髓系祖细胞及髓源性抑制细胞的自体扩增,尤其有利于粒/单核细胞进入血液循环,其具体机制可能与Notch信号促进应激损伤后造血干细胞增殖和上调IL-10表达有关。结论:成功构建了连接造血干细胞和造血微环境的新型Notch配体活性蛋白,证实Notch信号途径可能通过促抗炎因子表达,实现应激损伤后自体造血动员。