伤寒沙门菌外膜囊泡通过调控铁死亡抑制结直肠癌细胞的增殖及机制初探

近年来,细菌外膜囊泡(OMVs)在抗肿瘤治疗中展现出的巨大潜力引起了广泛的关注.为探究伤寒沙门菌外膜囊泡(S.Typhi-OMVs)对人结直肠癌细胞株HT-29增殖的影响及可能的作用机制,通过超速离心法提取不同细菌的OMVs,细胞增殖实验(CCK-8)检测各细菌OMVs对细胞活力的影响;转录组测序(RNA-seq)分析处理后细胞基因表达水平的变化;试剂盒检测铁死亡相关标志物的含量变化;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(western blot)分别检测相关基因mRNA和蛋白质的表达变化.结果显示,在提取的6种细菌OMVs中,S.Typhi-OMVs对HT-29细胞的增殖产生了最明显的抑制作用,并且呈现出浓度和时间梯度依赖性;RNA-seq显示HT-29细胞可能发生了铁死亡;S.Typhi-OMVs作用后,细胞内发生了铁沉积,氧化产物增多,抗氧化剂减少,符合铁死亡生化特征;SAT1是S.Typhi-OMVs处理后HT-29胞内mRNA表达量变化最大的基因;p53-SAT1-ALOX15是铁死亡的信号通路之一,S.Typhi-OMVs处理后胞内p53、SAT1、ALOX15的mRNA与蛋白表达均增高.以上结果表明,S.Typhi-OMVs能够抑制结直肠癌细胞HT-29的增殖,其机制可能与通过p53-SAT1-ALOX15信号通路诱导HT-29发生铁死亡有关.

不同培养条件下伤寒沙门菌外膜囊泡对结直肠癌细胞增殖的影响

为探讨不同培养条件下伤寒沙门菌外膜囊泡(outer membrane vesicle,OMV)对结直肠癌细胞增殖的影响,本研究采用超速离心法分别提取伤寒沙门菌在正常、酸性、高渗、氧化环境LB液体培养基及LPM液体培养基中分泌的OMV,并比较其形态、粒径及所含蛋白大小。体外培养结直肠癌HT-29、SW480及CT-26细胞,采用CCK-8实验检测OMV对结直肠癌细胞增殖的影响,并用克隆形成实验进一步验证;采用流式细胞术检测细胞周期;通过统计体重及肝、肾组织苏木精-伊红染色切片评价OMV在小鼠体内的毒性。结果显示,不同培养条件下伤寒沙门菌分泌的OMV在形态、大小方面无明显差异,高渗应激环境下分泌的OMV更多。OMV所含蛋白相对分子质量在正常和酸性环境LB液体培养基中为37×10^(3)~72×10^(3),在高渗和氧化环境LB液体培养基中为25×10^(3)~72×10^(3),在LPM液体培养基中为8×10^(3)~55×10^(3)。LPM培养条件下OMV能显著抑制SW480和CT-26细胞的增殖,将SW480细胞周期阻滞于G2/M期,且对小鼠无明显肝、肾毒性。结果表明,LPM培养条件下OMV对结直肠癌细胞SW480、CT-26增殖具有直接抑制作用,有望成为结直肠癌治疗的新方案。

伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统对SopE表达影响的初步研究

为探索伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统(type 6 secretion system,T6SS)对SopE表达的影响,阐明其中的分子机制,本研究利用自杀质粒同源重组法构建携带sopE∷3×Flag的伤寒沙门菌野生株(WT-pBAD33)、T6SS功能分子缺陷株(ΔsciG-pBAD33)和回补株(C-ΔsciG),用构建成功的菌株感染巨噬细胞THP-1并在模拟巨噬细胞内环境(LPM培养基、微需氧)下培养,通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)与蛋白质印迹法(Western blot,WB)试验探索T6SS对SopE表达的影响,采用β-半乳糖苷酶活性检测来进一步验证sopE基因启动子的转录水平,Ni柱纯化T6SS功能蛋白SciG,电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)研究SciG蛋白对sopE基因启动子的调控作用。结果显示:ΔsciG-pBAD33中SopE表达水平较于WT-pBAD33明显降低;SciG蛋白不能直接与sopE基因启动子区域结合。本研究结果表明,伤寒沙门菌T6SS影响了SopE的表达,但是其功能蛋白SciG不能直接调控sopE基因的表达。

fruA基因对伤寒沙门菌侵袭力和生物膜形成的影响

为探究fruA对伤寒沙门菌生长、毒力及生物膜形成的影响,利用pBAD33制备fruA的高表达菌株(WT-pfruA)及其空载体对照菌株(WT-pBAD33).通过细菌的生长曲线测定、泳动试验、T84细胞侵袭实验以及96孔微量板结晶紫染色法分别检测fruA对伤寒沙门菌生长、毒力及生物膜形成的影响;同时应用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析fruA对伤寒沙门菌毒力及生物膜相关基因的调控作用.结果显示,成功制备了伤寒沙门菌的WT-pfruA及其WT-pBAD33,发现高表达fruA后,伤寒沙门菌的生长无明显变化、运动能力增强、侵袭力上升、生物膜形成能力增加;同样地,与WT-pBAD33相比,WT-pfruA中动力、侵袭及生物膜相关基因的转录水平明显上调.综上,fruA基因可增强伤寒沙门菌的毒力及生物膜形成,并对其相关表型基因起正调控作用.

丁基苯酞对大鼠全脑缺血纹状体细胞外液氨基酸和多巴胺含量的影响

用大鼠４动脉阻断全脑缺血模型和大鼠纹状体灌流方法，观察到大鼠急性全脑缺血２０ｍｉｎ，纹状体细胞外液谷氨酸、牛磺酸、γ－氨基丁酸及多巴胺含量显著升高。丁基苯酞４０ｍｇ·ｋｇ－１能使全脑缺血２０ｍｉｎ纹状体细胞外液多巴胺及其代谢产物ＤＯＰＡＣ含量明显降低，并能降低缺血前后纹状体细胞外液甘氨酸含量，而对谷氨酸等其他氨基酸无显著影响。结果提示丁基苯酞对缺血性脑损伤可能有保护作用。

大鼠纹状体细胞外谷氨酸增多与氧自由基生成的相互作用

采用脑区微灌流技术结合以水杨酸为捕捉剂的IIPW－UV检测羟自由基方法和酶萤光检测谷氨酸方法，发现在大鼠纹状体细胞外灌流谷氨酸后，可使灌流液中的羟自由基显著增加，加灌氯胺酮可减轻谷氨酸的灌流效应。而灌流能产生超氧阴离子（O2）的黄嘌吟-黄嘌呤氧化酶系统，可使灌流液中的谷氨酸显著增加，给予维生素E则可消除这种效应。结果提示纹状体细胞外液中谷氨酸增多与氧自由基生成之间有相互促进作用。

大鼠急性全脑缺血及重灌后纹状体细胞外谷氨酸含量的变化

本文采用大鼠四动脉结扎全脑缺血模型和微透析技术结合谷氨酸酶荧光检测法观察到大鼠急性全脑缺血20分钟,纹状体细胞外谷氨酸含量显著增高;重灌第4天谷氨酸含量仍有显著增高,重灌第7天谷氨酸含量与缺血前相比无显著差异。结果提示大鼠急性全脑缺血期和重灌中期纹状体细胞外兴奋性氨基酸有过量增高。

外高桥保税区离岸贸易的发展现状、问题与对策

离岸贸易作为一种新型的国际贸易形式,已经成为国际贸易中的重要组成部分。本文在对上海外高桥保税区离岸贸易发展现状进行统计梳理的基础上,分析上海发展离岸贸易中存在的问题和主要瓶颈障碍,并就这些问题障碍进行分析,提出深入发展离岸贸易的政策建议。

伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株制备与分泌蛋白初析

目的观察伤寒沙门菌调节蛋白OmpR的调节作用，制备伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株，并比较分析野生株和OmpR缺陷变异株在不同渗透压环境培养下的分泌蛋白。方法用自杀质粒pGMB151介导同源性重组方法制备伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株，用PCR方法观察重组现象，变异株经测序和外膜蛋白的SDS—PAG电泳鉴定，用SDS—PAG电泳结合Western blot比较分析野生株和OmpR缺陷变异株在高、低渗透压环境培养下的SipC等分泌蛋白。结果成功制备伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株，并发现变异株中，包括SipC、鞭毛素蛋白在内的多种蛋白的表达分泌有明显差异。结论伤寒沙门菌OmpR在不同的渗透压下分别影响SipC、鞭毛素蛋白等多种蛋白的表达分泌。

跨国公司恶意并购民族品牌的动因及对策分析——从可口可乐并购汇源果汁所想到的

近年来,民族品牌在合资企业中被外商收购或丧失自主经营权的事例屡见不鲜。本文以可口可乐并购汇源果汁为例,分析跨国公司并购我国民族品牌的动因。跨国公司试图垄断中国市场的恶意并购,将给中国经济和企业带来了不利影响,我们必须提高警惕,严加防范,并制定相应的对策。

GPS及其RTK技术在公路勘测中的应用探讨

简述了GPSRTK技术在公路勘测中的应用现状、技术优势和发展趋势。讨论了GPS技术在公路首级平面控制网建立中的应用;GPSRTK技术在中线放样、横断面测量等方面的应用。

耐热AKP在高GC含量细菌染色体杂交方法中的应用

目的应用耐热碱性磷酸酶(AKP)于微孔板DNADNA杂交技术,建立高G+C含量细菌染色体DNA同源性测定的特异性方法,为此类细菌的分类与鉴定奠定基础。方法细菌染色体DNA经分离纯化并变性后,直接非共价结合于固相微孔板中,与标有光标生物素的DNA探针进行杂交。借助抗生物素蛋白与生物素的特异性结合,通过与板上带有生物素的杂交体作用,使得链霉亲和素连接的耐热AKP固定于板上,根据底物加入后的酶促反应强度,定量判读杂交结果。结果微孔板中1μg/孔DNA的包被浓度与25～50ng/孔的生物素探针呈现较为理想的杂交结果,pH95TrisHcl缓冲液系耐热AKP的最佳作用条件。应用该法于高G+C含量的分枝杆菌种间染色体同源性分析表明,方法具有敏感、特异、简便等优点。结论耐热AKP应用于微孔板定量杂交,可不受较高杂交和测定温度的影响,适用于高G+C含量的结核杆菌等分枝杆菌属以及假单胞菌属的定性检测和同源性的定量分析。

外资并购中民族品牌保护问题的思考——从可口可乐并购汇源果汁所想到的

近几年,外资并购事件频繁发生,其中不乏成功的例子,但是大多数的民族品牌却在并购后消失了,丧失了品牌优势。本文以可口可乐并购汇源果汁为例,分析跨国公司并购我国民族品牌的动因,并提出相应的对策。

自贸区战略下国际经贸人才培养思考

自贸区战略的提出对国际经贸人才的需求发生了改变,也对国际经贸人才有了更高的要求。本文分析自贸区战略下市场对国际经贸人才的具体要求,以上海工程技术大学国际经济与贸易专业为例,研究如何对接自贸区战略人才需求,实现国际经贸人才培养模式创新的途径,通过不断改革创新,形成鲜明的符合自贸区需求的人才培养特色。

z66抗体诱导伤寒沙门菌鞭毛抗原表达转变后染色体结构分析

目的 分析z66抗体诱导z66抗原阳性伤寒沙门菌鞭毛抗原表达改变后染色体结构。方法 利用脉冲凝胶电泳（PFGE）结合XbaI消化，对伤寒沙门菌标准菌株Ty2，z66抗原阳性株GIFU10007及z66抗体诱变j抗原阳性株GIFU10007-j的染色体DNA进行比较分析。结果 GIFU10007-j染色体DNA有两个XbaI片段与GIFU10007不同，总体染色体减少约250kb；与Ty2相比，GIFU10007染色体DNA有13个相同及7个不同的XbaI片段，总体染色体大小接近。结论 z66抗体诱导伤寒沙门菌鞭毛抗原表达转变后的染色体DNA发生了局部结构缺损；伤寒沙门菌z66鞭毛抗原阳性及诱变阴性株与单相标准菌株Ty2间在染色体DNA结构上有明显差异。

一种新颖简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法的建立

为建立一种新颖、简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法,根据实时定量标准曲线,推导出相对定量基因表达的公式.公式显示相对表达指数只与CT值和标准曲线的斜率相关.构建标准曲线的标准品需要通过克隆和体外转录获得,实验过程繁琐.当人为成比例增减标准品各个稀释度的具体拷贝数时,标准曲线的斜率并不改变,说明标准曲线斜率与标准品的具体拷贝数无关.因此,新的相对定量方法可以用任何一个待测样品的总RNA(或cDNA),经系列稀释后作为标准品,来构建相对定量标准曲线,获得斜率.与绝对定量法比较,新方法获得了基本相同的斜率和非常一致的定量结果(差异小于4%),而传统的2-#$CT法却表现出较大的定量误差.这些结果表明,新的相对定量方法是一种简便、准确和高效的定量基因表达的方法.

大鼠纹状体灌流谷氨酸对局部羟自由基生成的影响

采用脑区微灌流系统和水杨酸为捕捉剂的ＨＰＬＣ羟自由基检测法，观察到大鼠纹状体灌流０．１ｍｍｏｌ／Ｌ谷氨酸１５～３０ｍｉｎ内，灌流液中羟自由基和水杨酸反应生成的衍生物２，５－ＤＨＢＡ的浓度为３１０．４±１７１．８ｎｇ／ｍｌ（ｘ±ｓ，ｎ＝５）较谷氨酸灌流前的８４．８±３７．０ｎｇ／ｍｌ（ｘ±ｓ，ｎ＝５）含量显著增高（Ｐ＜０．０１）．而给予氯胺酮０．６ｍｇ／ｍｌ加灌组，谷氨酸灌流１５～３０ｍｉｎ内的２，５－ＤＨＢＡ浓度为１６５．４±８８．１ｎｇ／ｍｌ（ｘ±ｓ，ｎ＝５）。结果提示纹状体细胞外谷氨酸含量增加能使局部羟自由基生成增加且能被氯胺酮部分抑制。

T-bet、GATA3及相关因子的表达与胃癌及转移的相关性研究

目的:分析胃癌患者Th1和Th2两类细胞因子的基因表达与转录因子T-bet和GATA3表达的相关性,从细胞因子与转录因子角度考证胃癌患者Th1/Th2细胞分化趋势,探讨p53与T-bet的相关性,了解T-bet与肿瘤转移之间的关系。方法:利用荧光定量PCR技术检测55例胃癌患者及45例正常人外周血单个核细胞(PBMC)中T-bet、GATA3转录因子和IFN-γ、IL-4等细胞因子的水平,应用免疫组化法检测胃癌组织中p53的表达状况。结果:55例胃癌患者T-bet、GATA3、IFN-γ、IL-4的表达率依次为51%(28/55)、78%(43/55)、27%(15/55)、69%(38/55)。定量PCR结果显示,病人组的T-bet和IFN-γ明显低于正常对照组(P<0.01),而GATA3和IL-4则明显高于正常对照组(P<0.01)。T-bet与IFN-γ在病人体内的mRNA表达存在正相关性(P<0.01),正常人则没有。GATA3与IL-4的表达在两组中均呈明显正相关(P<0.01和P<0.05),且在p53阳性的患者中,T-bet的表达率较低,而GATA3的表达率较高。结论:胃癌患者有明显Th2漂移现象,且p53的表达与T-bet的表达呈负相关。

伤寒沙门菌基因组DNA芯片的制备与基因表达谱分析应用

伤寒沙门菌是一种具有鞭毛的革兰阴性人类肠道致病菌,也是一种重要的原核生物研究用模式菌.基因组芯片能够系统、全面且高效地观察生物的基因表达及进行基因组结构比较.利用伤寒沙门菌现有的全基因组序列,以Ty2菌株的基因组为基准,选取CT18菌株和z66阳性菌株的特异性蛋白编码基因,设计特异性引物,经PCR有效扩增出4201个基因,产物纯化后点样于多聚赖氨酸玻片制备伤寒沙门菌基因组DNA芯片,并验证了芯片样点位次与效果.通过对基因表达谱分析的各种条件进行优化,建立相应的表达谱分析方法,并用于比较伤寒沙门菌野生株在高渗、低渗条件下的基因表达差异,结果与以前的报道基本一致.结果表明,成功建立了伤寒沙门菌基因组DNA芯片及表达谱分析方法,可为有关伤寒沙门菌基因表达调控及致病性机理、进化和基因多样性等方面的深入研究提供有效的技术支持.

循环经济下企业破坏性创新的商业模式的研究

加快循环经济的发展是解决经济增长与资源环境之间矛盾的根本手段。企业是经济运行的微观主体之一,既是大部分物质产品的直接提供者,又是绝大多数污染物的直接生产者,因此循环经济要求企业在遵循自然规律的基础上,在经济生产活动中重新审视自身商业模式,以新的技术知识、新的管理理念尽可能达到资源循环利用的目的,从而实现环境保护与经济进步“双赢”的可持续发展。