高糖诱导HT-22小鼠海马神经元代谢记忆细胞模型的构建及影响

目的 体外构建高糖诱导HT-22小鼠海马神经元“代谢记忆”细胞模型,探究“代谢记忆”对HT-22细胞凋亡和组蛋白乙酰化的影响。方法 以高糖培养基(葡萄糖浓度为55 mmol/L)和常规糖培养基(葡萄糖浓度为25 mmol/L)培养HT-22细胞,分为常糖组(NG 4、6、8组,25 mmol/L葡萄糖分别培养4、6、8 d),高糖组(HG 4、6、8组,高糖培养4、6、8 d),代谢记忆组(HG2NG2、HG2NG4、HG2NG6、HG4NG2、HG4NG4组,即高糖2 d转25 mmol/L葡萄糖培养2、4或6 d,高糖4 d转25 mmol/L葡萄糖培养2 d或4 d)。CCK-8法检测细胞活力变化,检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)释放量,筛选出建立“代谢记忆”模型的最佳作用时间。后续将细胞分为NG4组、NG8组、HG4组、HG4NG4组和HG8组,光学显微镜观察各组细胞形态;流式细胞术检测各组细胞凋亡率;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测去乙酰化酶(HDAC)和组蛋白乙酰转移酶(HAT)活性;Western blot检测组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和胱天蛋白酶3(Caspase-3)蛋白表达情况。结果 HG4NG4组为理想的高糖“代谢记忆”细胞模型;NG4、NG8组细胞交织成致密网状,生长状态良好,细胞呈梭形,突触结构明显。而HG4、8组细胞胞体变圆,突触结构消失,生长受抑,HG4NG4组细胞数量增多但形态受损;流式细胞术结果显示,与NG8组相比,HG8、HG4NG4组凋亡率增加(P<0.05);ELISA结果表明,与NG8组相比,HG8组及HG4NG4组HAT和HDAC的水平均增高(P<0.05),与HG8组相比,HG4NG4组HAT和HDAC差异无统计学意义;Western blot结果显示,与NG8组相比,HG8组、HG4NG4组HDAC4、Bax和Caspase-3蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05),与HG8组相比,HG4NG4组蛋白表达差异无统计学意义。结论 HT-22小鼠海马神经元细胞经高糖55 mmol/L培养4 d后,再以25 mmol/L葡萄糖培养4 d是理想的高糖“代谢记忆”细胞模型。其机制可能与高糖模型中HDAC、HAT活性及HDAC4表达升高有关。

两种糖尿病脑病动物模型建立及应用

目的构建Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病脑病(DE)动物模型,比较二者应用的优缺点。方法Ⅰ型DE动物模型,选取20只SD大鼠:10只模型组(50 mg/kg链脲佐菌素腹腔注射),10只对照组(0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液腹腔注射);Ⅱ型DE动物模型,选取20只db小鼠:10只对照组(db/m小鼠),10只模型组(db/db小鼠)。观察各组精神状况、毛发光泽、饮食及饮水量等一般情况,监测各组体质量和随机血糖,记录每次数据变化情况;每月进行Morris水迷宫、Y迷宫、矿场实验等行为学试验,观察各组认知功能,记录变化情况;模型组出现认知功能障碍后处死动物取海马组织苏木素-伊红(HE)染色观察海马神经元形态学变化;透射电镜用于观察海马组织的超微结构变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组血清白细胞介素(IL)-1β和IL-18的浓度;Western印迹检测各组海马组织B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达水平。结果成功构建Ⅰ型和Ⅱ型DE动物模型,两种模型动物均能维持稳定高血糖;与对照组比较,Ⅰ型DE模型体质量明显降低,而Ⅱ型DE模型体质量明显升高(均P<0.05);多种行为学实验结果显示,两种模型均出现不同程度的认知功能障碍;Ⅰ型DE模型海马组织神经元和Ⅱ型DE模型海马组织神经元完全不同,前者细胞形态出现明显病变,而后者无显著变化;与各自对照组比较,两种模型组神经元细胞损伤严重,内质网和线粒体嵴出现脱粒和肿胀,突触结构破坏,数量减少;与对照组比较,两种模型组血清中促炎因子IL-1β、IL-18水平显著升高(均P<0.05);Western印迹结果显示,两种模型组海马组织Bax/Bcl-2蛋白水平显著高于对照组(P<0.05)。结论Ⅰ型DE模型在模型建立(链脲佐菌素腹腔注射)后第12周出现严重的认知功能障碍;Ⅱ型DE模型在出生后25 w开始出现认知功能障碍,如需观察严重认知功能障碍还需继续饲养。具体的实验模型选择,应根据模型的自身特点和要求,结合研究时间的长短和周期的划分,选用符合条件、适于研究的动物模型。

基于网络药理学方法和动物实验探讨制何首乌治疗非酒精性脂肪肝病的作用机制

目的基于网络药理学和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)动物模型实验,挖掘并验证制何首乌治疗NAFLD的作用机制。方法查阅文献比较何首乌及制何首乌药物成分的不同;通过HERB数据库及SwissADME查找筛选制何首乌药效成分,Swiss Target Prediction预测靶点,OMIM、DISGENET、GEENCARDS数据库筛选NAFLD相关靶点,药效成分靶点与疾病靶点互相映射,使用DAVIDV6.8进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,Cytoscape3.7.2绘制制何首乌治疗NALFD“成分-靶点-KEGG信号通路-疾病”网络;NAFLD小鼠行制何首乌灌胃治疗8周,检测血清甘油三酯含量及谷丙转氨酶活性;HE染色观察小鼠肝组织病变;Western blot实验对制何首乌治疗NAFLD的潜在作用机制进行验证。结果通过网络药理学筛选出了6种制何首乌治疗NAFLD的药效成分及32个潜在作用靶点,GO和KEGG通路富集到脂质和动脉硬化相关通路、AMPK信号通路等;与NALFD小鼠相比,药物干预组小鼠血清甘油三酯、谷丙转氨酶活性下降;HE染色验证制何首乌具有改善NAFLD的功能,且Western blot显示制何首乌干预后AMPK信号通路的脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FASN),乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl CoA carboxylase,ACC)及硬脂酰辅酶A去饱和酶1(Stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1)蛋白表达量相关。结论制何首乌可能通过调控AMPK信号通路相关蛋白FASN、ACC、SCD1表达,减少肝脂质新生,缓解NAFLD肝脂滴蓄积。

二苯乙烯苷、大黄素改善高糖诱导下小鼠海马神经元凋亡

目的探讨何首乌主要成分二苯乙烯苷(TSG)、大黄素(Emodin)对高糖诱导下海马神经元HT-22细胞凋亡的影响。方法将小鼠海马神经元HT-22细胞分为4组:对照培养基组(NC组,葡萄糖浓度25 mmol/L)、高糖培养基组(HG组,葡萄糖浓度55 mmol/L)、HG+TSG组和HG+Emodin组。HG+TSG组和HG+Emodin组分别用TSG和Emodin以50、100、200μmol/L的浓度作用细胞12、16、20、24、48 h,CCK-8法检测细胞存活率,确定细胞的最佳作用浓度和时间。流式细胞术检测细胞凋亡率;通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测4组细胞组蛋白乙酰化转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性;蛋白免疫印迹(Western blot)检测凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达。结果TSG以200μmol/L、48 h,Emodin以100μmol/L、48 h作用细胞为最适条件。流式细胞术结果显示,TSG和Emodin干预细胞48 h后,细胞凋亡率显著降低。ELISA结果显示,HG+TSG组的HAT活性显著下调,HDAC活性上调;HG+Emodin组的HAT和HDAC活性显著下调。Western blot结果显示,TSG和Emodin作用细胞48 h后,Bax和Caspase-3的表达显著下调,Bcl-2的表达显著上调。结论TSG和Emodin可能通过调节HAT和HDAC活性,从而改善在高糖诱导下的海马神经元细胞凋亡。

2种高糖诱导海马神经元模型应用及优势比较

目的比较2种高糖诱导海马神经元模型优缺点,探讨2种细胞模型在不同情况下应用效果。方法体外培养原代海马神经元和HT-22海马神经元细胞系,分为对照组和高糖组。神经元纯度鉴定,细胞活力检测,转染试剂对细胞活性和转染效率的影响,流式细胞术观察细胞凋亡情况,Western blot检测凋亡蛋白表达情况。结果原代海马神经元纯度85%以上;成功复制2种高糖诱导神经元细胞模型;高糖作用时间48 h,原代海马神经元细胞活性稳定在80%,HT-22细胞活性达95%以上;不同种脂质体转染试剂均能损伤2种细胞模型,LipoRNAiMax毒性较小,其中HT-22细胞受损小,HT-22细胞转染效率较高;2种模型细胞凋亡显著(P<0.05),其中原代神经元凋亡率更高,凋亡蛋白Bcl-2均表达下降、原代神经元Bax表达增高(P<0.05),HT-22细胞中Bax表达无差异。结论2种高糖诱导海马神经元细胞模型具备不同的优缺点,细胞模型的选择应根据实际情况考虑。

IRX5在原发性肝细胞癌患者血清中的表达及临床意义

目的探讨原发性肝细胞癌(HCC)患者血清中易洛魁家族同源盒基因5(IRX5)的表达及临床意义。方法收集117例HCC患者和52例肝脏良性疾病患者的血清样本及相应临床资料,以同时段46例健康体检者的血清样本作为对照组。采用酶联免疫吸附试验检测各组血清IRX5表达,采用德国罗氏公司全自动化学发光免疫分析仪(Cobas e411)和西门子ADVIA2400全自动生化分析仪分别检测血清甲胎蛋白(AFP)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。比较各组血清IRX5、AFP和ALT水平差异,观察不同临床特征HCC患者的血清IRX5水平,分析HCC患者血清IRX5与ALT、AFP的相关性,评价血清IRX5对HCC的诊断效能。结果HCC组血清IRX5表达量高于肝脏良性疾病组及对照组(P均<0.05),肝脏良性疾病组及对照组之间IRX5表达水平无统计学差异(P>0.05)。HCC组血清IRX5表达量与血清AFP水平呈正相关(r=0.27,P<0.05),与血清ALT水平无关(r=-0.082,P>0.05)。IRX5和AFP诊断HCC的受试者工作特征曲线下面积分别为0.738(95%CI:0.667~0.808)、0.838(95%CI:0.781~0.895);二者最佳临界值分别为27.41、7.55 ng/mL,诊断HCC的敏感性分别为73%、77.4%,特异性分别为72.7%、79.5%。血清IRX5与AFP比较,诊断HCC的ROC曲线下面积、敏感性、特异性均无统计学差异(P均>0.05)。结论IRX5在HCC中表达上调,其表达与血清AFP呈正相关,有望成为诊断HCC的候选标志物之一。

miR-452-5p对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响及作用靶点预测

目的观察miR-452-5p对肝癌细胞迁移、侵袭能力的影响,并预测其作用靶点。方法将肝癌SMMC7721细胞分为miR模拟组、对照1组、miR抑制组、对照2组;miR模拟组转染miR-452-5p mimic,对照1组转染miR-452-5p mimicNC,miR抑制组转染miR-452-5p inhibitor,对照2组转染miR-452-5p inhibitorNC;转染24 h后,采用细胞划痕实验和Transwell迁移实验检测肝癌细胞迁移能力,采用Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。miRNA靶基因预测软件得出EPB41L33'UTR含有miR-452-5p的结合位点,利用双荧光素酶报告实验验证miR-452-5p与EPB41L33'UTR的结合;采用Westernblotting法检测miR模拟组、对照1组、miR抑制组、对照2组细胞中的EPB41L3蛋白。结果miR模拟组细胞迁移率及Transwell实验迁移细胞数、侵袭细胞数高于对照1组(P均<0.05)。miR抑制组细胞迁移率及Transwell实验迁移细胞数、侵袭细胞数低于对照2组(P均<0.05)。双荧光素酶报告实验结果提示miR-452-5p可以直接结合EPB41L33'UTR,即EPB41L3是miR-452-5p的直接靶基因。miR模拟组细胞中EPB41L3蛋白表达低于对照1组,miR抑制组细胞中EPB41L3蛋白表达高于对照2组(P均<0.01)。结论miR-452-5p高表达可提高肝癌细胞的迁移侵袭能力,作用机制可能与靶向调控EPB41L3有关。