牦牛六个多能性相关转录因子OSKMNL的克隆和多顺反子慢病毒载体的构建

旨在克隆牦牛6个多能性相关转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28(OSKMNL),构建多顺反子慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry。本研究以1头3~5月龄健康雌性牦牛胎儿的生殖嵴组织为研究材料,利用RT-PCR技术克隆牦牛6个多能性相关转录因子OSKMNL的完整编码区序列,并对其进行生物信息学分析;应用无缝克隆技术构建慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;用293T细胞包装慢病毒,将包装好的慢病毒感染293T细胞和牦牛成纤维细胞,通过观察荧光表达和RT-PCR技术检测病毒感染情况(试验分为病毒感染组和空白对照组,每个组设置3个重复)。结果表明,克隆的牦牛OSKMNL基因的编码区大小分别为1 083、963、1 434、1 320、903、618 bp;序列分析发现牦牛OSKMNL氨基酸序列与黄牛的同源性在99%以上,其中Sox2、Klf4、c-Myc与黄牛的同源性为100%;进化树结果显示牦牛与黄牛、瘤牛、水牛的亲缘关系最近,与小鼠的亲缘关系最远;蛋白结构预测发现牦牛的6个转录因子OSKMNL都具有该基因家族相应蛋白功能的结构,比如POU结构域、HOX结构域、HMG结构域、Znf-C2H2结构域、HLH结构域、CSP结构域等;构建了慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;慢病毒感染293T细胞发现试验组表达红色和绿色荧光;慢病毒感染牦牛成纤维细胞发现试验组表达红色和绿色荧光,RT-PCR结果显示预期大小的条带。本研究成功克隆了牦牛的6个多能性相关转录因子OSKMNL;构建了分别携带牦牛3个转录因子的慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;包装的慢病毒能感染牦牛成纤维细胞。有利于推动多能性相关转录因子OSKMNL在牦牛干细胞中的应用,也为后续研究牦牛iPSC做准备。

GPR50在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达及亚细胞定位

旨在探究GPR50在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达规律及亚细胞定位.通过卵母细胞体外培养技术、qPCR技术及免疫荧光技术测定GPR50在小鼠不同时期卵母细胞的转录水平及亚细胞定位.结果表明,所建立的qPCR方法敏感性高、特异性强、重复性好且检测效率高,可用于测定GPR50在小鼠卵母细胞中转录水平的表达;GPR50在不同阶段小鼠卵母细胞中均有表达,生发泡破裂(GVBD)后,GPR50的表达量显著高于GV期(P<0.05);随着卵母细胞的发育,其表达量不断增高,到MII期达到顶峰,极显著高于GV、GVBD及MI期(P<0.01).随着卵母细胞的发育,GPR50大量表达于细胞质和细胞膜,但在成熟卵母细胞中,GPR50主要集中分布于细胞膜.以上结果说明,GPR50在小鼠卵母细胞体外成熟中发挥重要的作用,为解析GPR50在哺乳动物卵母细胞体外成熟进程的分子机制奠定了基础.