侧耳纤维素酶基因的克隆与表达研究

采用能够转化细菌和真菌的双功能质粒pDL1,与部分酶切的糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)基因组DNA片段进行体外重组.再用重组质粒DNA转化玉米黑粉菌(Ustilago maydis)的原生质体,在平皿上筛选抗新霉素的转化子,转化率达800转化子/μg DNA,由此在玉米黑粉菌中建立了糙皮侧耳的基因文库.随机选出25个转化子提取其DNA,以^(32)P标记的neu基因酶切片段作为探针进行打点杂交,全部显示阳性,证明抗性菌落不是来源于敏感细胞的回复突变.利用李氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维二糖水解酶(Cellobio_hydrases,简称CBHs)CBH Ⅱ基因末端片段为探针,从阳性克隆菌株中提取DNA进行Southern转移并杂交,结果证明,本研究已成功的克隆了糙皮侧耳纤维二糖水解酶CBH Ⅱ基因.基因的表达检测证明,克隆菌株具有纤维二糖水解酶活力.