肾上腺脑白质营养不良分子诊断中假基因干扰的排除

在基因组DNA水平 ,应用基因突变分析的方法对肾上腺脑白质营养不良进行分子诊断十分重要 .由于人体内存在多个肾上腺脑白质营养不良假基因的拷贝 ,应用PCR RFLP和PCR产物直接测序等常规方法难以检测一部分的基因突变 .为了排除基因组DNA中假基因的干扰 ,利用扩增阻滞突变系统 ,成功地分析了一个肾上腺脑白质营养不良 (R6 17G突变 )家系成员的基因型 .结果表明 ,扩增阻滞突变系统是排除假基因干扰的有效方法之一 .

7个肾上腺脑白质营养不良家系的基因突变分析

目的对7个肾上腺脑白质营养不良家系进行基因突变分析。方法应用RTPCR技术,对7位患者的ABCD1基因编码区分4个片段进行扩增并对PCR产物直接测序。应用PCR限制性酶切或DNA测序等方法分析相应的基因组DNA,进一步确证ABCD1基因的突变位点。结果在7位患者的ABCD1基因上存在6个不同的碱基置换(709CA、807GA、1161CT、2065CT、2113TC和2235CT)、1个碱基缺失(1801delAG)和1个碱基插入(1126insGCCATCG),分别造成5个错义突变(A141T、R259W、P560L、L576P和R617C)、2个移码突变(fsI246和fsE471)和1个无义突变(S108X)。结论在中国人肾上腺脑白质营养不良患者中发现4个新的ABCD1基因突变,即S108X、fsI246、R259W和L576P突变。不同家系具有不同的突变位点,且突变类型和表型之间无特殊的相关性。

应用两层法保存和运输成人胰腺的实验

目的:提高胰岛的分离纯化率是胰岛移植成功的关键,其中胰腺的冷缺血时间是主要影响因素之一。探讨并建立供体胰腺长时间(>8h)保存和运送方法。方法:实验于2006-06/2007-02在解放军南京军区福州总医院全军器官移植中心完成,得到医院伦理道德委员会批准。①实验方法:应用两层保存法(University of Wisconsin液/全氟化碳),将25例成人胰腺置于广口瓶中,充氧并盖紧,放入冰筒中送达实验室,按冷缺血时间的长短,分为>8h组(n=17)和≤8h组(n=8)。参照改良后Ricordi方法分离胰岛,将胰腺切片置入消化罐中循环消化。应用连续密度梯度离心法在COBE2991离心机中纯化胰岛组织,并用双硫腙、吖啶橙、碘化丙啶染色。②实验评估:分别进行纯化后胰岛计数、纯度和活率检测,同时检测胰岛对高、低糖的反应性。结果:①冷缺血时间>8h组胰腺的冷缺血时间显著长于≤8h组(P<0.01)。②经双硫腙染色后,两组分离纯化的总胰岛当量、胰岛收获量差异无显著性意义(P>0.05);两组胰岛纯度和活率差异也无显著性意义(P>0.05)。③经低糖、高糖分别刺激后,两组胰岛素释放量及其刺激指数差异均无显著性意义(P>0.05)。结论:应用两层保存法保存和运送供体胰腺,可明显延长保存时间,但对胰岛的分离纯化数量和功能没有明显影响,为胰岛移植远距离保存和运送腺体提供了有利条件。

肾上腺脑白质营养不良蛋白ATP结合区的原核表达与鉴定

目的 构建人肾上腺脑白质营养不良 ( adrenoleukodystrophy,ALD)蛋白 ( ALD protein,ALDP) ATP结合区的原核重组载体并进行表达和鉴定。方法 自行设计引物 ,通过 PCR技术 ,以人全血 RNA为模板扩增ALDP ATP结合区编码序列 ,PCR产物经 Eco R /Xho 双酶切后 ,将其克隆至 p GEX-4T-2载体中 ,在大肠杆菌 BL2 1中诱导 GST融合蛋白的表达。结果 在 IPTG的诱导下 ,重组菌高效表达出一相对分子质量约为42 0 0 0的产物 ,与预期大小相符。对重组质粒的序列分析表明 ,插入片段的序列与 Genbank登录的编码序列完全一致。Western blot结果显示 ,目的条带可被鼠抗人 ALDP单克隆抗体识别。结论 人 ALDP ATP结合区的编码序列已被克隆至 GST融合表达载体 p GEX-4T-2 ,并在大肠杆菌 BL2 1中获得高表达。

偶发分枝杆菌的感染与实验研究进展

偶发分枝杆菌 (M .fortuitum)为非典型分枝杆菌之一 ,其感染的病例日益增多。本文根据目前国内外所报道的偶发分枝杆菌感染 ,对其致病性、感染特点和耐药性 ,以及分子生物学现状 ,作一个初步分析和简述。

肾上腺-脑白质营养不良的实验室诊断进展

肾上腺脑白质营养不良是遗传性代谢疾病 ,由于基因突变 ,极长链饱和脂肪酸在患者血浆和组织中累积 ,引起脑白质脱髓鞘改变和肾上腺功能不全。对血浆、培养皮肤成纤维细胞极长链饱和脂肪酸的测定是诊断本病的主要生化指标 ,基因突变分析能准确发现发病家系的基因突变类型和突变位点 ,应用免疫学方法检测突变基因所表达的蛋白 ,联合极长链饱和脂肪酸测定、基因突变分析两种方法 ,能提高肾上腺脑白质营养不良的确诊率。

下呼吸道感染患者中产超广谱β-内酰胺酶菌株的药敏分析

目的 了解下呼吸道感染患者中肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶 (ESBL s)及产 ESBL s菌株的药敏情况。方法 收集 2 0 0 0年 10月～ 2 0 0 1年 10月从我院下呼吸道感染患者中分离出的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌 2 40株 ,用表型确认试验检测 ESBL s;用 Kirby- Bauer琼脂扩散法作药敏试验。结果 2 40株肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中 ,共检出产 ESBL s菌 78株 ,检出率为 3 2 .5 0 % ,其中肺炎克雷伯菌为 2 8.5 7% ,大肠埃希菌为 3 4.62 % ;除亚胺培南、头孢哌酮 /舒巴坦、哌拉西林 /他唑巴坦和头孢美唑外 ,产 ESBL s菌对其他 10种抗生素的耐药率均显著高于非产 ESBL s菌 (P<0 .0 1) ;亚胺培南、头孢哌酮 /舒巴坦、哌拉西林 /他唑巴坦和头孢美唑对产 ESBL s菌的耐药率最低。结论 下呼吸道感染患者中肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌产 ESBL s情况严重 ;产ESBL s菌对大多数抗生素耐药性比非产 ESBL s菌严重 ,亚胺培南、头孢哌酮 /舒巴坦、哌拉西林 /他唑巴坦和头孢美唑是治疗由产 ESBL

福州地区肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌的药敏监测

目的监测福州地区肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌对14种常用抗生素的药敏情况,为临床合理选用抗生素提供依据。方法收集2001年3月～10月福州地区4家医院分离的肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌426株,用K-B琼脂扩散法作药敏试验;用表型确认试验检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)。结果在14种抗生素中,敏感性最高的是亚胺培南(100%)、头孢哌酮/舒巴坦(100%)、哌拉西林/三唑巴坦(99.53%)、头孢吡肟(94.37%)和头孢美唑(91.08%),敏感性最低的是阿莫西林(12.68%)、哌拉西林(48.83%)和环丙沙星(50.70%);除头孢他啶外,第三代头孢菌素对肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌的耐药率均在30%以上;产ESBLs菌检出率为33.33%(142/426);除亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦和头孢美唑外,产ESBLs菌对其它10种抗生素的耐药率均显著高于非产ESBLs菌。结论亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦、头孢吡肟和头孢美唑的敏感性最高,产ESBLs是肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌产生耐药的主要机制之一,临床实验室有必要常规检测肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌是否产ESBLs。

临床标本的细菌分布及药敏分析

目的 探讨各种临床标本的细菌分布及常用抗生素的耐药性。方法 采用API系统鉴定细菌及药敏试验;同时进行大肠埃希菌和克雷伯菌的ESBLs检测,及耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的测定。结果 各种标本感染主要以大肠埃希菌、克雷伯菌、铜绿假单胞菌和葡萄球菌为主;所有革兰阴性杆菌对亚安培南的耐药率最低;对葡萄球菌、万古霉素和壁霉素的敏感性最好;其中大肠埃希菌和克雷伯菌的产ESBLs率为16.7％;MRS占所有葡萄球菌的69.5％。结论 医院感染已成为临床标本中最常见的感染,且细菌耐药率普遍较高,应引起临床和医院管理者的高度重视及合理使用抗生素。

年龄对人骨髓间充质干细胞分离培养的影响

目的:探讨年龄对骨髓间充质干细胞分离培养的影响以及在临床治疗中的意义。方法:通过分析183例人骨髓间充质干细胞分离培养情况,对比不同年龄段骨髓单个核细胞数、原代间充质干细胞数量、细胞增殖速度、细胞形态等方面的差异。结果:不同年龄段骨髓有核细胞、间充质干细胞免疫表型没有明显差异,单个核细胞数随年龄增长逐渐减少,但没有统计学差异。不同年龄段收获原代间充质干细胞数量、细胞增殖速度有明显差异(P<0.01)。年轻组、中年组收获原代MSC细胞明显多于年老组,增殖能力明显强于年老组。结论:随着年龄的增长,骨髓中间充质干细胞的数量减少,增殖能力衰退,在干细胞临床治疗中,不适宜从老年患者中获取骨髓来源的间充质干细胞。

一起死亡事故中难辨尸体的个体基因识别

目的对某地一起死亡事故中难辨认尸体进行个体基因识别。方法从遇难者尸体取深部肌肉和软骨组织少许。对部分组织进行常规病理检查。从尸体组织提取基因组DNA,采用荧光多重PCR技术,扩增尸体基因组DNA的16个短串联重复序列(STR)基因座。将遇难者STR基因型与父母的STR基因型进行比对,确定遇难者的家庭归属。结果常规病理检查示部分肌肉组织结构完全破坏,但软骨组织结构尚完整。肌肉组织基因组DNA的凝胶电泳呈3种类型:基本无降解、部分降解、完全降解。只有部分肌肉组织DNA可用于确定STR基因型,所有软骨的DNA样本均可用于STR-PCR。结论以STR基因型分析为基础的亲子鉴定技术是确定事故遇难者身份的有效方法。对腐烂尸体的STR分析而言,尸体软骨组织是首选。

大鼠胰岛细胞经门静脉肝内移植模型的建立

背景:由于肝脏既是胰岛素的作用部位,又是相对的免疫特惠区,排斥反应小,肝窦及其小静脉结构还有利于胰岛的居留和生长,可供移植容积大,有利于胰岛的生存,因此肝脏是一个较为理想的移植部位。目的:建立一种经门静脉胰岛细胞肝内移植治疗SD大鼠1型糖尿病的动物模型。方法:采用文献方法制备SD大鼠胰岛细胞。以腹腔注射链尿佐菌素诱导建立SD大鼠1型糖尿病模型,随机数字表法分为2组:实验组经门静脉主干穿刺输注SD大鼠胰岛1000胰岛当量1.5mL;对照组经门静脉主干穿刺输注无血清1640液1.5mL。术后未给予免疫抑制剂,观察两组大鼠出血量、血糖、胰岛素水平及肝脏组织形态学变化。结果与结论:所有大鼠均移植成活,门静脉穿刺一次成功率90%,出血量<0.5mL。胰岛移植大鼠血糖降为正常的时间1～6(3.7±1.7)d,移植胰岛存活时间为2～15(8.4±4.1)d。术后2周内实验组大鼠空腹血清胰岛素水平明显高于对照组(P<0.05,P<0.01)。病理结果证实,移植大鼠肝细胞形态、肝小叶结构均正常,肝实质未见坏死灶,血管内无血栓形成;门静脉主干未见狭窄,亦未发生感染,说明胰岛细胞在肝窦内存活并能发挥功能。证实大鼠胰岛经门静脉主干穿刺输注肝内移植是胰岛移植基础研究的理想模型。

新的肾上腺脑白质营养不良基因突变1例的鉴定

目的 :对 1例肾上腺脑白质营养不良 (ALD)患者及其家系成员的ALD基因的突变类型进行鉴定 .方法 :以外周血RNA为模板 ,采用长链RT PCR技术 ,分 4个片段扩增ALD基因mRNA的编码序列 ,对 4个PCR产物进行直接测序 ,筛查整个基因编码区 .通过限制性内切酶酶切分析患者及其家系成员基因组ALD基因片段 ,以进一步确证所发现的基因突变 .结果 :位于患者ALD基因第 6外显子的第 5 0 8位密码子存在一个新的错义突变CCC→CTC (P5 0 8L) ,患者母亲为突变携带者 ,患者父亲和妹妹不存在此突变 .结论 :发现中国ALD患者一个新的ALD基因突变 ,即P5 0

长期培养对基质细胞衍生因子1/CXCR4介导间充质干细胞迁移的影响

背景:人外源性的间充质干细胞能特异性地向损伤部位迁移,参与多种组织的损伤修复,然而其定向迁移的机制尚不清楚。目的:观察基质细胞衍生因子1对骨髓间充质干细胞定向迁移的影响。方法:体外培养不同个体的骨髓间充质干细胞,培养至第10代,检测细胞衰老状态。RT-PCR和细胞免疫荧光检测骨髓间充质干细胞CXCR4受体表达情况;体外迁移体系(Transwell)检测基质细胞衍生因子1对骨髓间充质干细胞迁移的影响。结果与结论:骨髓间充质干细胞在体外长期增殖后生长逐渐缓慢,在第6,7代衰老细胞增多,其CXCR4受体表达减少。基质细胞衍生因子1对骨髓间充质干细胞的趋化作用呈剂量依赖性。

DHPLC在X-连锁肾上腺脑白质营养不良分子诊断中的应用(附12例报告)

目的探讨DHPLC在X-连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)分子诊断中的应用。方法提取12个X-ALD家系及成员的外周血基因组DNA,分15个片段扩增ABCD1基因的10个外显子,应用DHPLC技术对其进行突变筛查,并对出现异常洗脱峰的PCR产物进行DNA序列测定,证实突变位点的存在。结果12个X-ALD家系存在12种不同的ABCD1基因突变,包括8个错义突变、2个移码突变和2个无义突变,即P534R、G343V、R259W、A141T、R401Q、K276E、Y174C、A314P、fs E471、fs A247、S108X和Q177X。结论DHPLC筛查结合DNA序列测定能快速有效检测出ABCD1基因突变。不同的X-ALD家系有不同的ABCD1基因突变位点,突变类型和表型之间无特殊相关关系。

中国人遗传性高铁血红蛋白血症患者中一个新的突变基因型的鉴定

目的:报道一例遗传性高铁血红蛋白血症患者还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素b5还原酶(b5R)基因突变情况。方法:采用逆转录-聚合酶链反应产物直接测序法,分析遗传性高铁血红蛋白血症患者b5R基因的cDNA全部编码序列;PCR结合限制性内切酶(PvuⅠ和AfaⅠ)酶切,分析患者和她的家庭成员b5R基因组DNA扩增片段。结果:两个b5R等位基因中,一个存在M176T(ATG→ACG)突变,另一个存在C203Y(TGC→TAC)突变,其中M176T(ATG→ACG)为新发现的b5R基因突变。结论:本研究鉴定的M176T/C203Y复合杂合子突变是该遗传性高铁血红蛋白血症患者的致病基础。

成人胰岛细胞的分离纯化与应用

目的探讨成人胰岛细胞分离纯化技术,为胰岛细胞移植治疗1型糖尿病提供大量高质量的胰岛细胞。方法使用LiberaseHI复合胶原酶和改良的Recordi自动胰岛细胞分离技术分离胰岛,采用COBE2991细胞淘洗仪连续密度梯度离心纯化胰岛细胞,用DTZ和AO-PI染色显微镜下评价胰岛细胞的数量、纯度和活性。结果该组研究共分离30例胰腺的胰岛,获得胰岛细胞数量平均为(316626±191972)IEQ,平均每克胰腺收获胰岛细胞3389IEQ,收获的胰岛纯度平均为(74.70±7.84)%,活度平均为(94.10±2.19)%,胰岛细胞刺激指数平均为(3.68±0.58)。在此基础上,成功实施7人12次的成人胰岛细胞移植。结论成功建立了改良的Recordi自动胰岛分离技术,获得大量高纯度有活性的胰岛细胞,为开展胰岛细胞临床移植提供了保障。

头孢吡肟对肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌的体外敏感性

目的 评价第四代头孢菌素头孢吡肟对 4 2 6株肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌的体外敏感性。方法 收集 2 0 0 1年 3～ 10月福州地区 4家医院分离的肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌 4 2 6株 ,用 Kirby-Bauer琼脂扩散法作药敏试验 :用表型确认试验检测 ESBL s。结果 4 2 6株肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌中 ,头孢吡肟的敏感性为 94 .37% ,仅次于亚胺培南 (10 0 % )、头孢哌酮 /舒巴坦 (10 0 % )和哌拉西林 /三唑巴坦(99.5 3% ) ,明显高于青霉素类抗生素哌拉西林 (48.83% )和第二代头孢菌素头孢呋辛 (6 0 .0 9% ) ,也高于第三代头孢菌素头孢曲松 (6 2 .91% )、头孢噻肟 (6 4 .79% )、头孢哌酮 (6 5 .73% )和头孢他啶 (88.2 6 % )。经表型确认试验证实 14 2株 (33.33% )为产超广谱 β-内酰胺酶 (ESBL s)菌 ;头孢吡肟对产 ESBL s菌和非产 ESBL s菌体外敏感性分别为 84 .5 1%、99.30 %。结论 头孢吡肟对肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌的体外抗菌活性高于第三代头孢菌素 ,低于亚胺培南、头孢哌酮 /舒巴坦和哌拉西林 /三唑巴坦 ,头孢吡肟可考虑作为医院内感染的经验性一线用药。

X-连锁肾上腺脑白质营养不良分子诊断中排除假基因干扰的一个新方法

目的:探讨X-连锁肾上腺脑白质营养不良分子诊断中排除假基因干扰的新方法。方法:应用长链RT-PCR技术扩增3个X-连锁肾上腺脑白质营养不良患者的ABCD1基因编码区全长,再分4个片段进行二次PCR,并对PCR产物直接测序;应用巢式PCR对ABCD1基因相应区域进行扩增,其中第一轮PCR产物覆盖ABCD1基因从外显子6至3′非编码区的一个大片段,并对PCR产物进行测序,分析患者的基因组DNA,进一步确证其ABCD1基因突变。结果:在3个X-ALD患者的ABCD1基因上,存在3个不同的碱基改变(2235C>T,2065C>T和2190A>T),分别造成2个错义突变(R617C和P560L)和1个无义突变(K602X)。结论:应用巢式PCR能快速、有效地排除X-ALD分子诊断中ABCD1假基因的干扰。