Ad-sTNFRI-IgGFc腺病毒载体的构建及其转染人气道平滑肌细胞

TNF-α是一种具有广泛生物学活性的前炎症细胞因子,参与哮喘整个病理生理过程。可溶性肿瘤坏死因子受体(sTNFR)可以拮抗肿瘤坏死因子活性,已被用来治疗与TNF相关的炎性疾病。将sTNFRI-IgGFc基因插入腺病毒穿梭质粒pDC316,与辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染HEK293细胞,重组产生Ad-sTNFRI-IgGFc,PCR鉴定毒种正确后,进行扩增、纯化和滴度测定,转染人气道平滑肌细胞,利用RT-PCR、免疫组化方法,流式细胞仪,ELISA检测转染后细胞中sTNFRI-IgGFc的转录和表达。实验结果证明成功构建了Ad-sTNFRI-IgGFc腺病毒载体,感染性滴度达3×1010TCID50/mL,200moi转染气道平滑肌细胞阳性率达99.32%,转染后气道平滑肌细胞在mRNA和蛋白水平均有sTNFRI-IgGFc表达。转染上清稀释64倍后仍对TNF有拮抗活性。为将表达sTNFRI-IgGFc腺病毒基因治疗哮喘的实验研究提供了基础。

重组腺病毒Ad-sTNFRI-IgGFc转染人气道上皮细胞及其表达的实验研究

目的构建携带人可溶性肿瘤坏死因子受体I胞外区和IgGFc融合基因的重组腺病毒载体(Ad-sTNFRI-IgGFc),体外转染正常人气道上皮细胞株(HBE135-E6E7),探讨重组腺病毒Ad-sTNFRI-IgGFc转染气道上皮治疗支气管哮喘的可行性。方法将sTNFRI-IgGFc基因插入腺病毒穿梭质粒pDC316,与辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染HEK293细胞,重组产生Ad-sTNFRI-IgGFc,PCR鉴定毒种正确后,进行扩增、纯化和滴度测定,转染培养HBE135-E6E7,流式细胞术检测转染效率,RT-PCR、免疫组化检测转染后细胞中sTNFRI-IgGFc的表达和转录。结果成功构建了Ad-sTNFRI-IgGFc,感染性滴度达3×1010TCID50/ml,转染后HBE135-E6E7在mRNA和蛋白水平均有sTNFRI-IgGFc表达。结论构建的Ad-sTNFRI-IgGFc可有效转染HBE135-E6E7,并在其中高效表达,并能拮抗TNF活性,为将表达sTNFRI-IgGFc腺病毒基因治疗哮喘的实验研究提供了基础。