2021—2022年我国部分地区Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及Hexon基因序列分析

为了解2021—2022年我国禽类养殖场中Ⅰ群禽腺病毒(GroupⅠfowladenovirus,FAdVⅠ)分子流行情况,试验通过病毒分离、PCR鉴定、鸡胚致病性试验、Hexon基因测序等方法对采集自2021—2022年我国15个地区共计250份疑似感染禽腺病毒的组织病料进行病原分析。结果显示:共分离出43株FAdVⅠ;Hexon基因扩增测序分析表明,其中36株与FAdV-C4型参考株核苷酸序列相似性在99.8%~100%,2株与FAdV-E8b型参考株核苷酸序列相似性达到93.8%~94.2%,1株与FAdV-A1型参考株核苷酸序列相似性达到99.5%,4株与FAdV-D11型参考株核苷酸序列相似性达到95.4%;FAdVⅠ感染在夏秋季节为高发期,阳性检出率较高的时间主要集中于4—10月。研究表明,我国15个主要养禽地区禽群中FAdVⅠ流行情况较为复杂,存在交叉感染和病毒基因重组风险,需要进一步调查其流行病学特征及研究其致病性。

猪德尔塔冠状病毒N蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】构建猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)核衣壳(N)蛋白原核表达系统并制备多克隆抗体,为新型疫苗、诊断试剂研发及PDCoV致病机制的深入研究提供基础。【方法】提取PDCoV HeN17株RNA,经RT-PCR扩增,将N基因克隆至pGEX-6P-1载体构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行IPTG诱导表达。利用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化重组蛋白,采用3C蛋白酶去除标签。以纯化后的N蛋白为免疫原免疫3月龄新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价,并通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)和免疫沉淀(IP)试验对其进行鉴定。【结果】成功构建原核表达载体pGEX-6p-1-PDCoV-N,获得的PDCoV-N-GST重组蛋白主要以可溶性形式表达,大小约69 kD,经去除GST标签可获得单一目的蛋白条带,经测定蛋白浓度为12.6 mg/mL,获得的PDCoV-N蛋白能与PDCoV阳性血清反应产生单一特异性条带。制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价达1∶4096000,可特异性识别pCAGGS-Flag-N转染HEK-293T细胞中表达的Flag-N蛋白和PDCoV感染LLC-PK1细胞中表达的PDCoV-N蛋白,且能检测到PDCoV-N真核表达载体pCAGGS-Flag-N转染HEK-293T细胞中表达的PDCoV-N蛋白。【结论】成功构建高效PDCoV-N原核表达系统,获得纯度好、浓度高且免疫原性佳的PDCoV-N蛋白,制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价高,具有较强亲和力和特异性,可用于Western blotting、IFA和IP检测。

3株鸭腺病毒3型的分离鉴定与主要结构蛋白的生物信息学分析

旨在对鸭腺病毒3型(duck adenovirus 3,DAdV-3)广东流行株进行分离,并预测分析六邻体(Hexon),五邻体(Penton),纤维蛋白(Fiber1、Fiber2)4个主要结构蛋白的理化性质、结构及功能。本研究用鸡肝癌细胞(LMH)对疑似DAdV-3感染的鸭、鹅肝脏组织进行病毒分离,对3株病毒分离株主要结构蛋白进行基因克隆、测序、拼接,获得4个蛋白的核苷酸序列后,使用MEGA 11软件进行氨基酸序列分析并构建遗传进化树,利用Expasy-ProtParam与SOPMA软件分析4个蛋白的理化性质与二级结构,应用AlphaFold2软件预测4个蛋白的三级结构,并对4个蛋白的线性B细胞抗原表位进行预测。结果:成功分离得到3株DAdV-3,命名为XZD-2021株、FRK-2021株、825-1-2021株;3株DAdV-3的4个蛋白均与GenBank中其他DAdV-3分离株处于同一分支中;Hexon蛋白更接近鹅腺病毒4型,Penton蛋白更接近D种禽腺病毒,Fiber1、Fiber2蛋白则更接近鸽腺病毒1型;4个蛋白均为酸性亲水蛋白,无信号肽,Hexon、Fiber1、Fiber2蛋白以自由卷曲为主,Penton蛋白则以α螺旋为主;三级结构预测结果与二级结构结果相符,线性B细胞抗原表位预测发现,Hexon蛋白的线性B细胞抗原表位最多,为11个,Penton蛋白与Fiber2蛋白为6个,Fiber1蛋白为5个,但Fiber1蛋白位于病毒表面的抗原表位最多,表位长度较Fiber2更长,且多位于负责与宿主细胞受体结合的头节区。综上,本研究成功分离得到3株DAdV-3,并对其4个主要结构蛋白进行了遗传演化、二级结构、三级结构等生物学特性进行分析,研究结果为后续DAdV-3致病特性和免疫特性研究奠定基础。

繁殖障碍型H3亚型猪流感病毒的分离与鉴定

于广东惠州市某猪场采集流产死胎的肺组织、胎衣及鼻棉拭子,病料处理后经SPF鸡胚绒毛尿囊腔接种获得1株有血凝(HA)活性的病毒,通过AGP试验初步确定为猪流感流感病毒;但此病毒的血凝现象不能被抗H1亚型猪流感单因子血清、抗H5亚型猪流感单因子血清、抗H7亚型猪流感单因子血清、抗H9亚型猪流感单因子血清抑制,而能被抗H3亚型猪流感单因子血清抑制;通过H3亚型猪流感病毒RT-PCR分子生物学诊断,最终确定该病毒为H3亚型猪流感病毒。动物回归试验结果显示,攻毒小鼠出现精神萎靡、厌食、嗜睡、被毛松乱、呼吸较急促,攻毒后7 d采集小鼠血清进行检测,HI效价为3log2～4log2;剖检发现病毒性肺炎,且能从病料中再次分离到H3亚型猪流感病毒。

禽流感、新城疫、传染性支气管炎病毒多联RT-PCR诊断方法的建立

利用分子生物学方法,选择禽流感病毒的M基因、新城疫病毒的F基因以及传染性支气管炎病毒的N基因,分别在基因序列的保守区域设计1对特异性引物,利用所合成的3对引物对相应靶基因进行RT-PCR扩增,在优化单项RT-PCR条件的基础上,建立禽流感、新城疫、传染性支气管炎病毒多联RT-PCR的检测方法,同时对该检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这3对引物分别能特异性地扩增出禽流感病毒的M基因片段、新城疫病毒的F基因片段及传染性支气管炎病毒的N基因片段,大小分别为385 bp、520 bp和748 bp,初步建立了快速、敏感、特异鉴别检测禽流感、新城疫、传染性支气管炎病毒的分子诊断方法。

H5、H9亚型禽流感病毒快速鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断我国目前流行的禽流感,根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计并合成2对特异性引物,利用这2对引物对H5、H9亚型禽流感病毒的HA基因片段进行二联RT-PCR扩增,并对二联RT-PCR检测方法进行了敏感性及特异性试验。结果表明,这2对引物能特异地扩增H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490bp和686bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立起快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。

支气管炎型H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

广东省某鸡场发生一起以严重呼吸困难、急性死亡为特征的病例,5000只鸡在1周内连续死亡400多只。通过病理剖检,几乎所有病死鸡支气管都充满干酪样物质,导致支气管严重阻塞,气管及支气管黏膜严重出血。采集病死鸡的肝脏、脾、肺和气管干酪样物质,病料经处理后通过SPF鸡胚绒毛尿囊膜接种获得一株病毒。通过琼脂凝胶免疫扩散(AGP)试验,该病毒能与禽流感标准阳性血清形成明显沉淀线,初步确定该病毒为禽流感病毒;通过血凝HA试验,该病毒能够凝集鸡红细胞,但此血凝现象不能被抗NDV血清、抗EDSV-76血清、抗H 5亚型流感单因子血清、抗H 7亚型流感单因子血清所抑制,而能被抗H 9亚型禽流感单因子血清所抑制,以及通过H 9亚型流感病毒的RT-PCR分子生物学诊断方法,最终确诊该病毒为H 9亚型禽流感病毒。动物回归试验,攻毒鸡表现与临床发病鸡一致的症状及典型病理变化,患鸡支气管被干酷样物严重阻塞,气管、支气管黏膜较严重出血,通过病料的病毒分离与鉴定,能再次分离到该病毒。

呼吸道病型H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

广东省某鸡场发生一起以严重呼吸困难症状、急性死亡为特征的病例,5 000羽122日龄清远麻鸡在一周内连续死亡400多羽。剖检后几乎所有病死鸡支气管充满干酪样物质,导致支气管严重阻塞,气管及支气管黏膜严重出血。病料接种SPF鸡胚绒毛尿囊膜获得一株病毒。通过AGP试验,该病毒能与禽流感标准阳性血清形成明显沉淀线;通过HA试验,该病毒能够凝集鸡红细胞,但此血凝现象不能被抗NDV血清、抗EDSV-76血清、抗H5亚型流感单因子血清、抗H7亚型流感单因子血清所抑制,而能被抗H9亚型禽流感单因子血清所抑制;进而通过RT-PCR方法,最终确诊该病毒为H9亚型禽流感病毒。动物回归试验,攻毒鸡表现与临床发病鸡一致的症状及病理变化,并能再次分离到该病毒。

流感病毒致病的分子基础

自然感染 ,流感病毒感染的宿主范围有较强的特异性 ,各毒株所表现的毒力也所不同。决定流感病毒宿主特异性和毒力的因素很多 。

兽医生物制品学课程思政教学建设探索

兽医生物制品学课程将“立德树人”课程思政融入教学之中。在注重知识传授和强化专业技能外,也要将思政育人元素贯穿于课程教学的过程中,提高学生的道德修养,激发学生家国情怀和社会责任担当的意识。以“三农”情怀为核心,引导学生“以智促农,以技兴农”服务农业农村现代化、服务乡村振兴的责任感和使命感,培养知农爱农创新人才。兽医生物制品学思政教学路径通过以“立德树人”为目标,提高教师团队的思政教学水平、将思政元素融入教学内容,结合互联网教学,最终对课程进行考核及教学评价等开展兽医生物制品学课程教学建设探索。

AIV致病分子基础的研究进展

在自然条件下 ,AIV感染的宿主范围有较强的特异性 ,各毒株所表现的毒力也有所不同。从 HA蛋白切割位点氨基酸序列、HA蛋白切割位点附近的糖基化位点数目、HA蛋白受体结合位点性质以及 NA茎区长度等方面 ,阐明了 AIV毒力的差异及其感染宿主特异性的分子机理 ,为更好地预防与控制 AIV奠定理论基础。下面对

H5、H7和H9亚型禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为快速、敏感、特异地鉴别诊断现较为重要的禽流感病毒亚型,根据H5、H7和H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成3对特异性引物,利用这3对引物对H5、H7和H9亚型禽流感病毒的HA基因片断进行多联RT-PCR扩增,并对多联RT-PCR检测方法进行敏感性及特异性实验。结果表明:3对引物能特异性地扩增出H5、H7和H9亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490bp,365bp和686bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立起快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。

高致病性禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断高致病性禽流感,根据H 5,H 7亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成两对特异性引物,利用这两对引物对H 5,H 7亚型禽流感病毒的HA基因片断进行二联RT-PCR扩增,并对二联RT-PCR检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这两对引物能特异性地扩增出H 5,H 7亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490 bp和375 bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立起快速、敏感、特异地鉴别检测H 5,H 7亚型高致病性禽流感病毒的分子诊断方法。

鳄鱼致病性粘质沙雷氏菌感染

三水森林公园１条母鳄鱼于１９９８年３月２６日死亡，第２天送来病死鳄鱼的肺和胃脏要求进行病原学检验。经分离鉴定，我们从肺和胃壁的坏死灶中分离出致病性粘质沙雷氏菌。报告如下。１流行情况从１９９８年１月至今，三水森林公园共有７只鳄鱼死亡，其中大部分未经任何...

抗禽流感iRNA提取及其部分免疫活性的研究

为了比较不同方法抽提抗禽流感iRNA的含量、纯度,以及了解iRNA对小鼠的免疫活性,本研究就抗禽流感iRNA提取及其部分免疫活性进行了研究。结果表明:酚-氯仿抽提与Trizol reagent试剂盒抽提的效果差异不显著,所得到的iRNA含量和纯度较高,而冷热酚法抽提的效果则明显不及酚-氯仿法与Trizol reagent试剂盒;小白鼠腹腔注射提取的iRNA制剂,小白鼠生长良好,10 d内未见小白鼠有死亡,由此说明iRNA对小白鼠是安全的;禽流感HI试验及ELISA试剂盒检测iRNA免疫小白鼠血清抗体,结果为阴性,由此说明抽提的iRNA不能诱导机体产生体液免疫。

鸡大肠杆菌荚膜多糖──蛋白质抗原免疫原性的研究

用碳化二亚胺作为交联剂将荚膜多糖与载体蛋白质交联后加入蜂胶佐剂制成疫苗免疫鸡只。７周龄同源菌株攻毒结果表明，荚膜多糖－破伤风类毒素苗组鸡有很好的保护效果且试验重复性好；在免疫后３个月的同源攻毒保护指数也达１３／２０以上。但对异源菌株的攻毒没有明显保护效果。该研究采用微量法间接血凝试验检测了免疫鸡抗体水平。

母鹅大肠杆菌卵黄性腹膜炎的诊治

广东省三水、清远、肇庆、南海、江门等市是养鹅业较发达的地区，近几个月来，这些地区不时有母鹅大肠杆菌卵黄性腹膜炎（俗称蛋子瘟）的病例发生，给养鹅业造成较大的损失。近日我校兽医院门诊部连续诊治了８例类似的病症，取得了良好的效果。现将母鹅大肠杆菌病的临床症...

H5、H9亚型禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断禽流感,根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成2对特异性引物,利用这2对引物对H5、H9亚型禽流感病毒的HA基因片段进行二联RT-PCR扩增,并对二联RT-PCR检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这2对引物能特异性地扩增出H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490bp和686bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立了快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。