天麻抗真菌蛋白GAFP-Ⅰ的一级结构和cDNA克隆

天麻抗真菌蛋白ＧＡＦＰ－Ⅰ是从天麻（ＧａｓｔｒｏｄｉａｅｌａｔａＢｌ）顶生球茎分离的１４ｋＤ蛋白，它能强烈抑制腐生真菌菌丝的生长，在天麻限制和防止密环菌（Ａｒｍｉｌａｒｉａｍｅｌｅａ）侵染球茎的防卫机制中起重要作用。本文报告ＧＡＦＰ－Ⅰ的一级结构和ｃＤＮＡ克隆的核苷酸序列。首先测得Ｎ－末端７个氨基酸序列为ＳＤＲＬＮＳＧ－用以合成一个简并引物，由天麻营养球茎提取ＲＮＡ，通过３′－ＲＡＣＥ技术扩增到一个６００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，直接克隆到ｐＧＥ－Ｔ载体中测定核苷酸序列。根据ｃＤＮＡ核苷酸序列和用羧肽酶Ａ测得ＧＡＦＰ－Ⅰ的Ｃ－末端为－ＡＳＧ，确认该ｃＤＮＡ含有４２９ｂｐ编码区，它编码一条１２９个氨基酸的ＧＡＦＰ－Ｉ和１４个氨基酸的Ｃ－末端扩展肽。同时，分离和纯化ＧＡＦＰ－Ⅰ经过羟胺裂解和α－糜乳胰蛋白酶消化产生的肽段，经自动Ｅｄｍａｎ降解程序测出它们的氨基酸序列。结果表明，由此测出的ＧＡＦＰ－Ⅰ氨基酸序列和由ｃＤＮＡ核苷酸序列推导出的序列９８４％一致。ＧＡＦＰ－Ⅰ由１２９个氨基酸组成，富含Ａｓｎ（１９）、Ｇｌｙ（１４），２９和５２位间有一对双硫键，计算分子量为１３９５８Ｄａ。ＧＡＦＰ－Ⅰ与雪花莲（Ｇａｌａｎ?

天麻中抗真菌蛋白质的诱导和积累

前曾报告从天麻（ＧａｓｔｒｏｄｉａｅｌａｔａＢｌ，）中分离出一种对木霉菌丝生长有强抑制作用的蛋白质，命名为天麻抗真菌蛋白，简称ＧＡＦＰ，也称为Ｇａｓｔｒｏｄｉａｎｉｎ。对不同天麻材料来源的ＧＡＦＰ分析表明：ＧＡＦＰ的相对分子量为１４ｋＤ，等电点可能不同，变动范围８．１—９．３。体外抑菌试验证明ＧＡＦＰ对腐生性真菌如木霉和密环菌等有强抑制活性，半抑制浓度ＩＣ０．５为０．０８ｍｇ／ｍＬ；对寄生性真菌如棉花枯萎病和稻瘟病作用很弱。对球茎生长期中７个阶段ＧＡＦＰ的含量测定和ＧＡＦＰ免疫荧光组织定位观察证明：１．ＧＡＦＰ是营养茎被密环菌侵染诱导而后大量合成的，合成部位可能是大型细胞。２．ＧＡＦＰ由营养茎输送到顶生球茎，积累于皮层细胞中，是皮层细胞的主要蛋白成分。３．营养基衰败后，顶生球茎ＧＡＦＰ的总量下降不多，直至抽苔时转移到花茎中。结果说明ＧＡＦＰ是天麻的一种重要功能蛋白质，是使顶生球茎处于拒菌状态的主要物质。