骨髓间充质干细胞与多发性骨髓瘤细胞共培养后CX43表达及SDF-1α分泌水平的变化及其意义

目的构建多发性骨髓瘤（MM）细胞与骨髓间充质干细胞（Msc）共培养体系，探讨共培养后MSC连接蛋白43（CX43）表达及基质细胞衍生因子（SDF）-1a分泌水平变化及其意义。方法用Westernblot、免疫荧光法检测MM细胞系及MM原代细胞CX43的表达及SDF-1a分泌水平。建立间接及直接共培养体系共培养MM细胞和MSC，然后用CD138磁珠法分离RPMI8226细胞及MSC。用实时定量PCR、Westernblot法检测共培养前后MSCCX43表达，免疫荧光法检测CX43分布；划痕实验检测共培养后MSC间间隙连接通讯（GJIC）变化；微孔隔离实验检测18a-甘草次酸（18a—GA）对MSC诱导的RPMI8226细胞迁移的影响。ELISA法检测共培养后的MSCSDF—1a分泌水平。结果MM细胞系RPMI8226、U266、1／3MM细胞及MM原代细胞CX43mRNA呈中、低度表达，XG-4、XG-7细胞不表达CX43。骨髓MSC高表达CX43。直接或间接共培养后骨髓MSC的CX43mRNA相对表达量明显提高，分别是单独培养时的1．36倍和2．10倍，Westernblot检测显示共培养后MSCCX43蛋白表达水平也上调，免疫荧光染色显示增高的CX43主要分布在胞质。划痕实验显示在MSC与RPMI8226直接共培养后荧光染料在细胞间扩散距离增加。MSC与RPMI8226细胞直接和间接共培养体系中，MSC培养上清SDF．1et水平分别为（373．02±10．11）和（309．714-10．71）pg／ml，高于共培养前[（237．84±9．23）pg／m1]（P〈0．01），该作用可被18a-GA抑制降为（126．01±4．80）和（106．99±3．39）pg／ml。18et—GA可抑制MSC诱导的RPMI8226细胞迁移，其作用前后RPMI8226细胞迁移率分别为（8．00--0．67）％及（4．82：50．19）％。结论MM细胞与MSC直接和间接共培养均可上调MSCCX43表达水平，并促进SDF—let的分泌。间隙连接阻断剂18et—GA可降低共培养体系中SDF—1a的分泌并抑制MSC诱导的MM细胞迁移。

Cx43表达与多发性骨髓瘤细胞耐药的相关性

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)连接蛋白43(Cx43)表达对多发性骨髓瘤(MM)RPMI 8226细胞耐药的影响。方法体外分离、培养BMSCs,采用RT-PCR法检测BMSCs、RPMI 8226细胞Cx43的表达,流式细胞术和多重液相蛋白定量技术分别检测BMSCs与RPMI 8226细胞共培养对RPMI 8226细胞凋亡和细胞因子分泌的影响。结果 BMSCs及RPMI 8226细胞均表达Cx43。BMSCs与RPMI 8226细胞共培养后,上清液中IL-6、IL-10和TGF-β水平增加,硼替佐咪诱导的RPMI 8226细胞凋亡作用减弱;而细胞间隙连接通讯(GJIC)特异性阻断剂18α甘草次酸(18α-GA)能明显逆转上述观察指标的改变过程。结论 BMSCs与RPMI 8226细胞间可形成功能性GJIC,是BMSCs促进MM细胞生存及介导其耐药的重要原因之一。

多发性骨髓瘤细胞株PRIM8226侧群细胞分选及其生物学特性的研究

目的 检测和分选多发性骨髓瘤（MM）细胞株PRIM8226中的侧群细胞（SP细胞）并鉴定其生物学特性.方法 以Hoechst33342/碘化丙啶（PI）荧光染料双染,维拉帕米拮抗对照,应用流式细胞术荧光激活分选法检测并分选MM细胞株PRIM8226 SP细胞,并通过细胞生长曲线、细胞周期、免疫表型、集落形成实验、RT-PCR检测干细胞特异标志物mRNA表达量、裸鼠体内成瘤实验等对SP细胞的生物学特性进行初步探讨.结果 MM细胞株PRIM8226 SP细胞含量为（1.78±0.89）％,采用流式细胞术成功分选SP细胞.生长曲线显示：SP细胞分选初期生长较主群细胞（MP细胞）缓慢,进入稳定增长期后增殖能力与MP细胞差异无统计学意义（P＞0.05）.细胞周期分析显示：SP细胞与MP细胞相比,周期多处于Go/G1期[（44.34±3.09）％、（28.49±1.97）％,P＜0.05],较少的细胞处于S期[（38.83±3.69）％、（51.49±4.62）％,P＜ 0.05].在免疫表型研究中,观察到SP和MP细胞的CD138、CD38表达分别为（78.5±8.5）％、（82.0±4.0）％和（72.3±15.7）％、（84.3±11.9）％,差异均无统计学意义（均P＞0.05）.MM细胞株PRIM8226 SP细胞的单细胞克隆直径、克隆形成数、克隆形成率均高于MP细胞[0.280±0.016和0.118±0.019、1 722±127和358±14、（86.1±3.46）％和（17.9±1.88）％,P＜0.05].RT-PCR显示SP细胞干细胞标志性基因的表达高于MP细胞：c-myc[（29.90±3.73）％、（16.84±2.35）％]、KIF4[（29.97±2.89）％、（19.06±1.23）％]、SOX2[（40.00±4.58）％、（16.62±2.09）％]、OCT4[（32.96±1.56）％、（23.27±0.92）％]（均P＜0.05）.裸鼠体内成瘤实验显示SP细胞成瘤能力显著高于MP细胞（最低成瘤数量分别为5×103、5×105个）.结论 MM细胞株PRIM8226的SP细胞在静止期细胞比例、集落形成能力、干细胞标记c-myc、KIF4、SOX2、OCT4基因表达量、体内成瘤能力上与MP细胞差异均有统计学意义,而SP细胞和MP细胞在体外长期增殖能力、CD38和CD138的表达上差异均无统计学意义.