丝裂霉素C诱导小鼠NIH-3T3细胞出现衰老相关分泌表型

衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)是指随细胞衰老而出现的分泌功能亢进,其分泌的因子参与细胞衰老、免疫调节、血管生成、细胞增殖及肿瘤侵袭等过程。与人类细胞相比,目前小鼠细胞的体外SASP模型尚十分缺乏,而建立该模型将为研究SASP的发生机制及生物学作用提供便利。为此,本文以INK4a基因座缺失(编码p16INK4a蛋白)的小鼠NIH-3T3细胞系及野生型小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)为研究对象,用丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)诱导细胞DNA损伤,并通过细胞形态、衰老相关β-半乳糖苷酶(β-gal)活性染色、Ed U整合率、Western blot、定量RT-PCR及ELISA等检测方法,观察细胞的衰老情况及SASP因子的表达和分泌水平。结果显示,MMC(1μg/m L)处理12 h或24 h,并继续培养到第8天后,NIH-3T3细胞体积变大,β-gal染色阳性(蓝染)细胞的百分率明显升高,分别达到77.4%和90.4%,并伴有P21蛋白表达上调及Ed U整合率下降(P<0.01)。同时,IL-6、TNF-α、IL-1α和IL-1β等常见SASP基因的m RNA表达水平显著上调,ELISA检测证明IL-6的分泌量亦显著升高(P<0.01)。相反,尽管MMC处理12 h或24 h也能诱导野生型MEF出现细胞体积增大、β-gal染色阳性率升高(分别达71.7%和80.2%)及P21表达上调,但其IL-6的分泌量无显著上升。本研究表明,MMC能诱导NIH-3T3和野生型MEF出现细胞衰老,但只有NIH-3T3细胞出现了典型的SASP现象。衰老NIH-3T3细胞可能是研究小鼠SASP的合适模型。