海分枝杆菌中sRNA5.85的功能及调控机制探索

目的:鉴定海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)中s RNA5.85的存在,探究s RNA5.85对分枝杆菌的生理影响及调控机制。方法:Northern-blot验证分枝杆菌中s RNA5.85的存在后,利用pMV261质粒,构建s RNA5.85过表达重组海分枝杆菌(5.85-OE株),观察重组菌株在体外生长、滑动能力及菌落形态变化。通过人源巨噬细胞感染模型,评估重组菌株的入胞及胞内增殖能力,LDH检测感染后的细胞活力。利用斑马鱼感染模型,验证s RNA5.85对细菌毒力的影响。结合targetRNA2与IntaRNA预测工具,预测s RNA5.85的潜在靶标及互作位点,并使用qRT-PCR验证。结果:海分枝杆菌基因组中存在s RNA5.85。过表达s RNA5.85不改变重组菌株的体外生长、滑动能力和菌落形态;5.85-OE株感染巨噬细胞48 h后,不影响THP-1的细胞活力,细菌胞内增殖能力与野生型无显著差异;s RNA5.85过表达会提高海分枝杆菌长期感染过程中,在斑马鱼体内的载菌量。targetRNA2预测的4个潜在靶基因MMAR_3476、MMAR_4052、MMAR_3482、MMAR_2920的转录水平随s RNA5.85过表达而显著上调,MMAR_3476及MMAR_4052共享同样的与s RNA5.85的互作位点。结论:s RNA5.85可通过调控低氧响应相关基因的表达,提高长期感染过程中对斑马鱼的毒力。本研究为致病性分枝杆菌中s RNA的挖掘和功能解析提供了重要线索。

结核分枝杆菌sRNA Mpr5的功能验证

【目的】探究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)中sRNA Mpr5对分枝杆菌的抗逆性及宿主细胞生理的影响。【方法】构建结核分枝杆菌sRNA Mpr5过表达的重组耻垢分枝杆菌(Mycolicibacterium smegmatis,M.smeg)M3-Atc,以转入空载质粒(pSI)的野生型耻垢分枝杆菌T1-Atc作为对照,观察细菌体外生长能力和菌落形态变化。通过非生物胁迫处理(低氧、饥饿、0.02%十二烷基硫酸钠)探究重组菌株的抗逆能力。用重组耻垢分枝杆菌侵染人非小细胞肺癌上皮细胞系A549,活菌涂板计算细菌的胞内增殖能力,利用免疫荧光染色观察感染后细胞的生理结构变化。【结果】sRNA Mpr5过表达菌株的体外生长与菌落形态均与野生型相似。抗逆性实验表明Mpr5过表达菌株(M3-Atc)的抗表面活性剂能力在4 h时显著提高(P<0.05);在饥饿模型中M3-Atc早期(2–12 h)就表现出生长劣势(P<0.05);低氧模型中M3-Atc菌株0–3 d均处于生长优势状态,增长均高于对照组(P<0.05),3d后增长幅度低于对照组。Mpr5过表达不影响菌株对上皮细胞侵染能力及细胞毒力,但降低了细菌早期胞内存活及增殖能力。【结论】sRNA Mpr5的过表达影响细菌对低氧、饥饿的环境应激,改变其对上皮细胞的感染能力,可能影响分枝杆菌的致病能力。