人GPR81-Gi1α融合蛋白在杆状病毒系统中的表达及优化

旨在建立获得融合蛋白GPR81-Gi1α的方法和最优条件。采用RT-PCR从人胚胎肾及大脑组织总RNA中分别扩增孤儿G蛋白偶联受体GPR81和Gi1α的完整表达序列(分别为1 041bp和1 065bp),并构建各自的重组质粒pcDNA3.1(+)-GPR81及pcDNA3.1(+)-Gi1α,再以重组质粒为模板,运用重叠延伸PCR法扩增得到融合基因GPR81-Gi1α,测序无误后将融合基因与pFASTBac1重组得重组质粒pFASTBac1-GPR81-Gi1α,而后转化DH10Bac,使该融合基因重组质粒发生特异性的转座和病毒重组,获得杆状病毒表达穿梭质粒pBacmid-GPR81- Ci1α,再将该重组杆粒转染昆虫sf9细胞,获得含杆状病毒的细胞分泌上清,以上清在不同条件下(包括不同感染时间、滴度等)感染sf9细胞以优化融合蛋白在昆虫sf9细胞的表达条件。结果表明,感染72h且感染强度moi为5时是融合蛋白在sf9细胞中高效表达的理想条件。该表达体系的建立及蛋白表达条件的优化,保证了足量GPR81- Gi1α融合蛋白的制备。

注射用银杏达莫的安全性评价

目的:评价国产注射用银杏达莫的安全性.方法:将注射用银杏达莫配成适当浓度,观察豚鼠静脉注射后有无过敏反应、家兔静脉注射有无血管刺激性及热原反应、体外溶血试验中是否具有溶血和血球凝集作用,小鼠静脉注射的急性毒性.结果:豚鼠静脉注射银杏达莫无过敏反应,家兔静脉注射银杏达莫无血管刺激性及热原反应,体外溶血试验无溶血和血球凝集作用,小鼠静脉给药测的LD50及95%的可信限为138.2mg·kg-1和118.5mg·kg-1～158.0mg·kg-1.结论:注射用银杏达莫可供静脉注射试用给药.

α-酮戊二酸钠对CHO-hGPCRc细胞内游离钙离子浓度的影响

目的:研究α-酮戊二酸钠对CHO-hGPCRc细胞内钙离子浓度的影响,并分析其变化的原因,从功能上进一步鉴定人源G蛋白偶联受体hGPCR c表达细胞的可靠性。方法:将重组表达质粒pcDNA3.1(+)-hGPCRc转染入CHO-K1细胞,经G418(800μg/m l)作用7~10 d,挑选、扩增阳性克隆,得到CHO-hGPCR c细胞,再以RT-PCR检测所得细胞内hGPCRc mRNA的表达;然后用不同浓度的α-酮戊二酸钠诱导该细胞,通过激光扫描共聚焦显微镜观察F luo-3标记细胞内钙离子变化,以及细胞外钙离子对其影响。结果:(1)RT-PCR结果表明,所得CHO-hGPCR c细胞能够稳定表达hGPCR c的mRNA;(2)α-酮戊二酸钠可引起细胞内钙离子浓度的变化,表现为钙波动幅度明显增加,并呈浓度依赖性;(3)α-酮戊二酸钠引起的细胞内钙波动,不是细胞外钙离子内流所致,而是细胞内钙库动员的结果。结论:α-酮戊二酸钠为hGPCRc的特异性配基,CHO-hGPCRc细胞能够稳定表达具有功能活性的hGPCRc受体,为进一步开展hGPCRc研究奠定了基础。

链脲佐菌素诱发糖尿病性肾病大鼠模型的特点

目的：建立糖尿病性肾病（diabetic nephropathy，DN）大鼠模型，观察DN发生发展过程中大鼠肾脏相关功能及结构的变化特点。方法：二级Wistar雄性大鼠60只，体质量180～220g，分为2组：正常对照组和模型组各30只。模型组大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ，65mg／kg），正常对照组注射等量的枸橼酸缓冲溶液。在注射后第6、10、12、16和32周，分别动态监测大鼠的体质量、血糖、24h尿蛋白和肌酐、肾脏质量及病理改变等。结果：随着病程的发展，模型组大鼠持续高血糖，体质量明显降低，24h尿蛋白、尿蛋白／尿肌酐比值则逐渐升高，肾脏明显肥大，而且肾小球和肾小管病变在第10周开始出现，之后病变程度逐渐加重、病变范围不断扩大，表现出较为典型的DN变化特点，诸如肾小球系膜增厚、细胞外基质增生及肾小管间质损伤等。结论：STZ可成功诱导大鼠持续性高糖血症，后者的进一步发展，又可引起大鼠肾脏功能受损和形态改变。高糖血症持续12周后，DN大鼠模型的明显特征开始显现。