人转铁蛋白基因的克隆及序列分析

目的:克隆人转铁蛋白基因并对其编码序列进行分析。方法:以人胎肝cDNA为模板,利用PCR方法克隆人转铁蛋白基因;通过与基因组序列对比分析基因组结构;通过TargetP 1.1和S ignalP 3.0预测信号肽;通过C lustal X(1.81)进行蛋白序列联配。结果:PCR扩增了一个长2 160 bp的基因片断,序列分析表明其覆盖了完整编码框,编码由698个氨基酸组成的人转铁蛋白。进一步分析发现人转铁蛋白基因有19个外显子和18个内含子,编码人转铁蛋白N端具有19个氨基酸组成的信号肽序列。人转铁蛋白与猩猩、猴子、兔子和老鼠的转铁蛋白氨基酸相似率分别为94%、91%、78%、73%。生物信息分析表明,人转铁蛋白含有高度保守的参与蛋白二硫键形成的半胱氨酸以及铁离子结合位点,有两个序列较同源的结构域。结论:成功克隆人转铁蛋白基因,人转铁蛋白与其它物种转铁蛋白同源。

双元Ti载体的发展

双元Ti载体是目前植物基因工程中最重要的植物转化载体。近年来双元Ti载体得到迅速的发展,新的载体不断出现。新发展的双元Ti载体结构优化,适用范围广,易于基因克隆操作,同时提高了植物转化的效率,更便于进行植物基因功能的研究。本文介绍了构建高容量载体、多基因载体、定点整合载体所采用的新策略。

小鼠锰超氧化物歧化酶在大肠杆菌中的表达和纯化

为构建小鼠锰超氧化物歧化酶(SOD)的原核表达载体,在大肠杆菌中进行蛋白表达、纯化和功能检测,以小鼠肝脏cDNA为模板,利用PCR方法克隆小鼠锰SOD基因,PCR扩增了1个长600bp左右的基因片段,该片段编码由198个氨基酸组成的成熟的小鼠锰SOD蛋白.将其插入pET15b载体中,经测序鉴定正确后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta-gami.含有pET15b-mMn-SOD质粒的工程菌经过IPTG诱导能表达出相对分子质量约25000的目的蛋白,超声破碎菌体,经Ni-NTA纯化后得到纯度约为95%的重组mMn-SOD蛋白.SOD活性检测表明经过诱导表达的mMn-SOD比活力为531.7U/mg.

一步法RT-PCR克隆水稻线粒体磷转运蛋白基因及其序列特征分析

以水稻广亲和品种Cpslo17幼穗为材料,用一步法RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)克隆了一个长度为1118bp的编码线粒体磷转运蛋白的OsMPT基因。序列分析表明其包含了基因完整的编码序列,编码由368个氨基酸组成的线粒体磷转运蛋白,它与玉米、大豆、Lotusjaponicus、Betulapendula、拟南芥的线粒体磷转运蛋白氨基酸序列相似率分别为93.5%,85.6%,83.8%,83.7%,81.1%。氨基酸疏水谱分析显示它有线粒体磷转运蛋白家族高度保守的6个跨膜结构域。水稻线粒体磷转运蛋白N端富含精氨酸(Arginine)、丙氨酸(Alanine)和丝氨酸(Serine)。iPSORT预测其蛋白N端具有定位于线粒体的信号肽序列,进一步分析表明此编码区段有6个外显子和5个内含子。RT-PCR结果表明,OsMPT基因在水稻两个亚种粳稻和籼稻的叶片中均有表达,在Cpslo17营养器官和生殖器官中都有高水平表达。水稻线粒体磷转运蛋白的克隆和表达分析将为研究其结构和生物学功能奠定基础。

人锰超氧化物歧化酶基因剪接异构体的表达分析

对人锰超氧化物歧化酶(human manganese superoxide dismutase,hMn-SOD)基因剪接异构体进行分析,并检测异构体的表达情况。在GenBank库中检索人锰超氧化物歧化酶基因异构体及编码基因组序列,利用Vector NTI9生物软件进行核酸及蛋白序列比对;利用RT-PCR方法分析锰超氧化物歧化酶基因异构体的表达。结果显示,在GenBank库检索发现有3种人锰超氧化物歧化酶基因异构体,剪接异构的类型为可变的5′剪接位点和外显子盒,各异构体基因内含子均符合"GT-AG"规则。3种基因异构体编码两种异构体蛋白,即222个氨基酸的人锰超氧化物歧化酶蛋白以及中部缺少39个氨基酸的截短型异构蛋白。RT-PCR检测结果表明,剪接异构体hMn-SODb在HEK293T和HSC细胞中的表达比在HepG2细胞中高,未见异构体hMn-SODc的表达。

人α-防御素基因的克隆及其在293T细胞中表达的临床意义

目的克隆人α-防御素(α-HNP)基因,构建重组真核表达质粒pCG-HNP并检测其在293T细胞中的表达。方法提取人PBMC细胞的RNA,以其为模板用RT-PCR技术克隆人α-HNP的cDNA,并将其插入质粒pCG中构建真核表达载体。测序证实后,将重组质粒用脂质体法转染293T细胞,用蛋白质免疫印迹法(Western)检测目的蛋白分子的表达。结果测序证实克隆的人α-HNP阅读框正确完整,PCR鉴定和酶切鉴定证实插入方向正确,免疫印迹结果显示重组质粒能够在293T细胞中表达HNP-GFP-Flag融合蛋白。结论α-HNP基因成功克隆;其在293T细胞中的表达可为进一步研究其抗HIV活性奠定基础。

人血清白蛋白基因的序列特征分析

目的克隆人血清白蛋白(HSA)基因并对其序列进行分析。方法利用PCR方法从人胎肝cDNA中克隆HSA基因片段,用DNASIS(2.5)软件分析核苷酸及其推导的氨基酸序列,用SignalP3.0Server预测N末端氨基酸信号肽,用ClustalX(1.81)和GeneDoc对蛋白序列进行多重序列联配分析。结果成功克隆HSA基因,有15个外显子和14个内含子,与猴、猫、牛、兔和老鼠的蛋白氨基酸相似率分别为93%、82%、76%、75%、73%;含有3个保守的白蛋白结构域。结论本研究为开发长效蛋白药物奠定了良好的基础。

Sap30调节小鼠造血干细胞的损伤恢复和体外扩增

目的:探究在5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导损伤修复和体外培养条件下,Sap30基因缺失对小鼠造血系统的影响。方法:以野生型小鼠作为对照组,Sap30基因敲除小鼠作为实验组。(1)应用流式细胞术检测Sap30基因在对照组和实验组小鼠血液细胞中的表达,每组5~8只小鼠。(2)应用流式细胞术检测野生型小鼠和Sap30基因缺失小鼠外周血、骨髓和脾脏中B细胞、T细胞及髓系细胞比例,胸腺中T细胞比例,以及骨髓中造血干/祖细胞比例,每组5~8只小鼠;利用造血干细胞体外培养及体内移植技术,检测Sap30基因缺失对小鼠造血干细胞克隆形成、归巢及重建造血能力的影响,每组3~5只小鼠。(3)利用5-FU诱导的化疗模型,检测Sap30基因缺失对小鼠外周血中血细胞数目以及骨髓中造血干/祖细胞数目和比例的影响,每组4~5只小鼠。(4)利用造血干细胞体外培养模型,检测Sap30基因缺失对小鼠造血干/祖细胞体外扩增的影响,每组4~5只小鼠。结果:(1)相较于淋系细胞,Sap30基因在小鼠血液系统的髓系细胞中特异性高表达(P<0.05);(2)Sap30基因缺失对小鼠造血系统无显著影响(P>0.05),对小鼠造血干细胞重建造血能力及归巢能力无显著影响(P>0.05);(3)Sap30基因缺失显著促进了小鼠造血干/祖细胞在5-FU损伤后的再生(P<0.05);(4)Sap30基因缺失显著促进了小鼠造血干/祖细胞的体外扩增(P<0.05)。结论:Sap30基因缺失促进了小鼠造血干细胞在5-FU处理后的损伤恢复以及体外培养条件下的扩增。

人锰超氧化物歧化酶的扩增和表达研究

构建人锰超氧化物歧化酶的原核表达载体,对影响蛋白表达的因素进行探索,并初步检测其活性。以人293T细胞cDNA为模板,利用PCR方法克隆人锰超氧化物歧化酶基因,将其插入pET15b载体中,经测序鉴定正确后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta-gami,通过IPTG诱导,SDS-PAGE检测菌体总蛋白。利用SOD检测试剂盒检测粗提物的SOD活性。结果:PCR扩增了一个长597bp的基因片断,该片断编码由198个氨基酸组成的成熟的人锰超氧化物歧化酶蛋白。经过IPTG诱导表达出约25k的蛋白。优化的IPTG浓度为0.25mmol/L,在1～6h范围内随着诱导时间的增加表达量逐渐增加,IPTG总量一样的情况下分次加入比单次加入所诱导的目的蛋白产量高。SOD活性检测表明经过诱导表达的hMn-SOD具有SOD活性。结论:成功扩增人锰超氧化物歧化酶基因,并构建了原核表达载体,经过IPTG诱导表达的目的蛋白有SOD活性。