乳酸通过胆固醇对非小细胞肺癌细胞中Hedgehog信号通路活性的影响

目的观测乳酸通过胆固醇对非小细胞肺癌细胞中Hedgehog(Hh)信号通路活性的影响。方法本研究用乳酸(0.0mM、7.5mM、15.0mM、20.0mM)和胆固醇(0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL)处理A549、NCI-H1703细胞6、24h,即刻检测Hh信号通路靶基因、胆固醇代谢合成酶相关基因或蛋白表达水平,并测定细胞内总胆固醇水平;为排除pH值对研究结果的影响,用相同浓度乳酸钠(7.5mM)处理A549、NCI-H1703细胞24h,用qPCR法检测胆固醇代谢合成酶相关基因表达水平;通过胆固醇合成酶抑制剂辛伐他汀(0.2uM)和乳酸(0.0mM、7.5mM、15.0mM、20.0mM)同时处理A549细胞24h,检测Hh信号通路靶基因表达水平;同时用RTCADPlus法检测增殖及迁移情况。结果经乳酸、胆固醇分别处理后的A549、NCI-H1703组细胞与对照组细胞比,前者GLII、PTCHImRNA水平上调(P<0.05);经乳酸处理后的A549细胞总胆固醇水平和HMGCR、FDFTI、SQLEmRNA水平均升高(P<0.001),同时HMCCR、FDFT1蛋白水平增高;经乳酸及乳酸钠分别处理后的A549、NCI-H1703细胞HMGCR、FDFTImRNA水平升高(P<0.01)。用0.2μM辛伐他汀下调胆固醇水平(P<0.05)后,GLI、PTCHImRNA水平下调(P<0.01);乳酸能够逆转辛伐他汀对GLII和PTCHImRNA水平的抑制作用,对A549细胞增殖(F=3.941,P=0.020)、迁移(F=5.851,P=0.003)能力的抑制作用。结论乳酸可能通过上调非小细胞肺癌细胞的胆固醇水平,促进Hh信号通路活性,并提高细胞增殖、迁移能力,提示抑制乳酸生成可能会改善辛伐他汀针对非小细胞肺癌的疗效。

乳酸上调非小细胞肺癌细胞中总胆固醇水平的机制研究

背景胆固醇与非小细胞肺癌发生相关并增强非小细胞肺癌细胞耐药性,研究显示乳酸能通过降低pH使SREBP2活化进而上调细胞内胆固醇水平。目的探索乳酸调节非小细胞肺癌细胞内总胆固醇水平的其他分子机制。方法分析TCGA数据库中非小细胞肺癌乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)与胆固醇合成代谢酶基因表达水平的相关性。将人肺支气管上皮细胞BEAS-2B和人非小细胞肺癌细胞H1299分为对照组(正常培养)和乳酸处理组(在培养基中添加乳酸),将人非小细胞肺癌细胞A549分为对照组(正常培养)、乳酸处理组(在培养基中添加乳酸)和盐酸处理组(在培养基中添加盐酸)。利用总胆固醇测定试剂盒测定细胞内总胆固醇水平,qPCR测定细胞内胆固醇合成代谢酶基因的mRNA水平。利用染色质免疫共沉淀分析对照组和乳酸处理组A549细胞中胆固醇合成代谢酶基因启动子区组蛋白乳酸化水平。结果Wilcoxon秩和检验分析TCGA数据结果显示,LDHA高表达的非小细胞肺癌细胞中胆固醇合成代谢酶基因HMGCR、ACAT1、ACAT2、SQLE和FDFT1表达水平升高(P<0.05)。独立样本t检验分析对照组和乳酸处理组细胞内总胆固醇水平及胆固醇合成代谢酶基因的mRNA水平,结果显示,与对照组细胞相比,乳酸处理组BEAS-2B、A549和H1299细胞内总胆固醇水平升高(P<0.01),且乳酸处理组BEAS-2B和A549细胞中HMGCR、FDPS、GGPS1和SQLE基因mRNA水平也升高(P<0.01)。与对照组相比,乳酸和盐酸处理组A549细胞内总胆固醇水平均升高(P<0.05),且HMGCR和FDFT1基因mRNA水平也升高(P<0.01),但盐酸的作用显著弱于乳酸(P<0.01)。染色质免疫共沉淀结果显示,乳酸处理组A549细胞中HMGCR、SQLE和GGPS1基因启动子区组蛋白乳酸化水平有升高趋势;与对照组相比,乳酸处理组A549细胞内总胆固醇水平升高(P<0.01),而乳酸脱氢酶抑制剂草氨酸钠能逆转乳酸上调A549细胞内总胆固醇水平(P<0.01)。结论乳酸能上调非小细胞肺癌细胞内总胆固醇水平,该过程可能的分子机制为组蛋白乳酸化修饰促进胆固醇合成代谢酶基因表达,且乳酸通过转化为乙酰辅酶A参与胆固醇合成。

乳酸对人非小细胞肺癌细胞A549生物学特性影响的研究

背景肿瘤的重要特征之一是代谢异常,乳酸作为代谢产物也参与肿瘤代谢。目的探讨乳酸对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞A549糖酵解压力、增殖、迁移和周期等生物学特性的影响。方法培养人非小细胞肺癌细胞A549,分为对照组、5 mmol/L乳酸处理组和10 mmol/L乳酸处理组。对照组不作任何处理,其他两组乳酸处理24 h后,通过Seahorse细胞代谢分析仪分析乳酸处理后A549细胞的糖酵解压力和线粒体底物选择,qPCR检测糖酵解相关基因(HK3、LDHA、LDHB、PKM)和细胞周期及迁移相关基因(CCNE1、CCND1、CCNB1、CDK2、CDH1、TWIST1、SNAI2)mRNA表达水平,Western blot检测糖酵解相关蛋白(G6PD、PKM2、HK1和LDHA)水平。利用实时无标记细胞分析(real time cellular analysis,RTCA)、流式细胞术分析乳酸对NSCLC细胞A549增殖、迁移、周期等生物学特性的影响。结果两个乳酸处理组相较对照组糖酵解降低,糖酵解最大能力及糖酵解储备均降低且10 mmol/L乳酸处理组比5 mmol/L组降低更显著(P<0.05),糖酵解关键酶在mRNA和蛋白水平下调。10 mmol/L乳酸处理组与对照组相比,对脂肪酸的依赖性增强,对谷氨酰胺的氧化能力减弱(P<0.05);RTCA结果显示两个乳酸处理组相较对照组细胞迁移降低,增殖能力降低,10 mmol/L乳酸处理组较5 mmol/L组增殖和迁移能力下降更为显著(P<0.05)。两个乳酸处理组CCNE1、CCND1、CCNB1、TWIST1基因m RNA水平下调,CDK2、CDH1基因mRNA水平上调。流式结果显示10 mmol/L乳酸处理组G0/G1期细胞增多(P<0.01),S期细胞数量降低(P<0.05),G2/M期细胞数量降低(P<0.05)。结论加入外源乳酸处理后,A549细胞糖酵解能力降低,且与乳酸浓度呈负相关,细胞氧化底物变化,随着乳酸浓度的增加其细胞增殖及迁移能力显著降低,通过细胞周期结果分析后推测加入外源乳酸可能使A549细胞抑制在G1期。

Hedgehog信号通路在食管癌中的异常活化

目的:探讨Hedgehog(Hh)信号通路与食管鳞状细胞癌(ESCC)的关系。方法:采用免疫组织化学随机分析30例ESCC及癌旁组织样本的Hh信号通路中主要组分Smo和Gli2及靶蛋白CyclinD1表达。构建分泌型配体ShhN的条件培养液,利用条件培养液及Hh信号通路激动剂Purmorphamine或Hh通路抑制剂环杷明及GANT61处理CaEs-17细胞后,MTT法检测细胞生存率的变化。结果:ESCC组织中的Smo、Gli2和CyclinD1表达普遍高于癌旁组织。含有ShhN的条件培养液能有效激活Hh信号通路下游靶基因CCND1的表达并明显促进食管癌CaEs-17细胞的生存率,提示食管癌中Hh信号通路以配体依赖的方式激活。直接作用于Smo的Hh信号通路激动剂Purmorphamine促进食管癌CaEs-17细胞的生长;而Smo特异性抑制剂环杷明有效地抑制CaEs-17细胞生存率。Gli1/Gli2的抑制剂GANT61比环杷明更为有效地抑制CaEs-17细胞生存率。结论:Hh信号通路在ESCC中异常活化,将可能成为新的治疗食管癌的药物靶点。

多房棘球蚴源性外泌体对巨噬细胞极化的影响

目的探究不同时间及浓度多房棘球蚴源性外泌体对巨噬细胞极化的影响。方法从60只造模BALB/c小鼠中随机选取4只,应用7.0T MRI观察腹腔病灶生长情况;解剖造模小鼠,通过腹腔病灶提取原头节进行体外培养,超速离心法从培养上清中提取外泌体,透射电镜及蛋白质免疫印迹法鉴定外泌体表征。将未加外泌体处理的巨噬细胞单独培养组设为对照组,不同浓度多房棘球蚴来源外泌体与巨噬细胞共培养组设为实验组(10μg/mL组、50μg/mL组),分别共培养48 h和72 h,显微镜下观察巨噬细胞形态变化。通过流式细胞术和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测极化状态。符合正态分布的计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果7.0T MRI显示小鼠腹腔内弥漫分布、大小不等的病灶形成;多房棘球蚴源性外泌体直径100 nm左右,呈杯型或茶托型,其表面标志物CD9、TSG101和CD63表达阳性。共培养后,实验组大部分细胞拉长,形态不规则,主要呈多角形;流式细胞术检测发现,共培养48 h,对照组CD16/32、CD206、CD369阳性率分别为(99.53±0.06)%、(90.27±0.21)%、(2.40±0.20)%;与对照组相比,除10μg/mL外泌体组CD369阳性率[(0.80±0.00)%]降低(P<0.05),其余组别CD16/32、CD206、CD369阳性率均明显升高(P值均<0.0001);共培养72 h,对照组CD16/32、CD206、CD369阳性率分别为(99.67±0.06)%、(85.47±0.55)%、(6.60±0.20)%,实验组CD16/32、CD206、CD369阳性率较对照组均明显升高(P值均<0.05)。ELISA结果示:共培养48 h,对照组IL-6及TNFα水平分别为(58.53±15.52)pg/mL、(320.70±5.30)pg/mL,实验组外泌体浓度为50μg/mL时IL-6[(98.81±15.55)pg/mL]较对照组升高(P<0.05);共培养72 h,对照组IL-6及TNFα水平分别为(76.22±9.68)pg/mL、(323.90±87.37)pg/mL,当外泌体浓度为10μg/mL时TNFα水平[(164.20±14.17)pg/mL]较对照组明显下降(P<0.05);当外泌体浓度为50μg/mL时IL-6水平[(99.52±8.35)pg/mL]较对照组升高(P<0.05)。结论多房棘球蚴源性外泌体可调控巨噬细胞极化,且在浓度为10μg/mL,共培养72 h后,可导致巨噬细胞M2样极化,具体方式有待进一步研究。

乳酸对非小细胞肺癌细胞线粒体自噬的影响

目的本研究旨在探讨乳酸对人非小细胞肺癌细胞线粒体自噬的影响。方法将人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)和非小细胞肺癌细胞(A549)分别给予常氧(21%O_(2))和低氧(1%O_(2))处理,测定细胞在常氧和低氧条件下的乳酸生成情况;用外源乳酸(0、5、10mM)在常氧和低氧条件下分别处理BEAS-2B和A549细胞,应用qPCR法分析线粒体DNA拷贝数,用蛋白免疫印迹法检测LC3B、TOM20、HSP60蛋白水平;使用Mitotracker■Red(581/644nm)、Lyso View Blue法检测线粒体及溶酶体共定位情况。结果与常氧组相比,低氧组BEAS-2B和A549的乳酸生成量明显升高(P<0.05)。未用乳酸干预时,相比于常氧组,低氧组A549线粒体拷贝数明显增加(P<0.0001),BEAS-2B线粒体拷贝数明显减少(P<0.0001);用乳酸干预后,常氧组和低氧组A549线粒体拷贝数随乳酸浓度增加而减少,BEAS-2B线粒体拷贝数变化则呈相反趋势。与对照组相比,常氧组和低氧组经乳酸干预后,BEAS-2B、A549细胞中的LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值增加,A549细胞中的HSP60、TOM20蛋白表达水平下降,而BEAS-2B细胞中的HSP60、TOM20蛋白表达水平无明显改变;在常氧和低氧条件下与对照组相比,Lac-10mM组A549细胞线粒体和溶酶体荧光共定位增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论乳酸可以增强非小细胞肺癌细胞线粒体自噬功能。

提高软化水供应稳定性研究

本文通过对钠离子交换器软化水周期制备量及软化水供应稳定性进行分析,探索提高钠离子交换器周期制备量,消除软化水供应存在的断流现象。首先,对钠离子交换器周期制备量偏低问题进行鱼骨图分析,找到主要原因反洗参数配合不合理、正洗参数设置不合理、再生参数配合不合理以及置换参数不合理,通过控制单一变量,重新设定相关参数,实现交换器周期制备量最大化。通过运用TRIZ46个发明原理中的“预先作用”原理,在软化水供应流程中增设止回阀、修改PLC程序消除软化水供应存在的断流现象。本文不仅为提高软化水制备能力提供了有益的借鉴,同时也为提升软水供应稳定性提供了实用的方案,对于其他生产企业的软化水处理优化,本文也提供了一个重要的参考。

卷烟厂除尘系统安全运行探究

以青州卷烟厂除尘设备为研究对象,通过运用风险程度分析法(MES)判定设备风险项目的风险级别,并采用改造旧设备、技术创新、持续改进等多种手段将风险级别在四级及以上的风险项目降为0,提高除尘设备安全性。

细粒棘球蚴脂肪酸转运蛋白生物学特性分析

本研究根据NCBI GenBank数据库中的Eg-FATP氨基酸序列,采用生物信息学方法分析细粒棘球蚴脂肪酸转运蛋白(Eg-FATP)理化性质,亚细胞定位、抗原表位、信号肽、跨膜区二级和三级结构、系统进化树、蛋白互作网络等,并通过qPCR方法探究其在原头蚴和包囊壁的差异表达,旨在为后期相关的研究提供理论支持和数据参考。结果显示,Eg-FATP蛋白无信号肽,无跨膜区,亚细胞定位于细胞质;该蛋白有10个B细胞线性表位和14个CTL细胞表位;系统发育分析显示:细粒棘球蚴的FATP蛋白与多房棘球蚴亲缘关系较近,细粒棘球蚴中国株和英国株之间的氨基酸序列同一性较高,为97%左右。预测的互作功能蛋白可能参与胆固醇代谢的调节、脂肪酸跨血屏障的转运等过程;GO和KEGG富集分析结果显示,Eg-FATP对长链和超长链脂肪酸具有酰基辅酶A连接酶活性;qPCR结果显示,FATP基因在原头蚴阶段转录水平较高于包囊壁,具有统计学意义(P<0.05)。本研究对细粒棘球蚴FATP基因的生物学特性进行了初步分析,为进一步揭示其生物学功能奠定了基础。

维生素A对呼吸道上皮细胞线粒体功能的作用机制

目的维生素A(VA)能够促进呼吸道上皮细胞增殖.分化,但作用机制尚不明确,文章旨在探索VA是否通过调控线粒体功能影响人正常主支气管上皮细胞生长代谢以及初步的作用机制。方法采用CCK-8检测VA对细胞增殖及毒性影响并结合VA缺乏的诊断标准确定VA给药量,将人主支气管上皮细胞分为4组,即对照组、VA-0.1 mg/L组、VA-0.5 mg/L组、VA-2 mg/L组,培养24.48 h。采用细胞能量代谢仪检测不同浓度VA对细胞线粒体有氧代谢的影响;qPCR分析细胞线粒体DNA拷贝数及线粒体自噬相关P62基因表达水平。结果VA处理HNTEC细胞24h后线粒体耗氧量相较于对照组增高,处理浓度为0.5mg/L时细胞线粒体耗氧量最高、ATP生成最多、最大呼吸潜能最高、质子漏增加;处理48h,0.1.0.5 mg/L处理组的结果与24h-致。VA-0.5 mg/L组、VA-2 mg/L组24 h线粒体拷贝数(328 333.00±66 583.28、3553 333.00±262 742.00)较对照组(2813 333.00±40 414.52)和VA-0.1 mg/L(2953 333.00±40 414.52)明显升高(P<0.01);VA-2 mg/L组.VA-0.5 mg/L组24 h线粒体拷贝数较VA-0.1 mg/L组明显升高(P<0.01);VA-2 mg/L组24 h线粒体拷贝数较VA-0.5 mg/L组明显升高(P<0.05)。VA-0.1 mg/L组48 h线粒体拷贝数(8475715.00+44489.78)较对照组(8331 365.00±5 435.18)明显升高(P<0.01);VA-2 mg/L组.VA-0.5 mg/L组48 h线粒体拷贝数较VA-0.1 mg/L组明显降低(P<0.01);VA-2 mg/L组48 h线粒体拷贝数较VA-0.5 mg/L组明显降低(P<0.01)。VA处理24.48 h后,P62基因的表达较对照组明显升高,且随着VA浓度的增加而增加.差异有统计学意义(P<0.01),但在48h,干预浓度为2mg/L较0.5mg/L P62基因表达稍降低(P<0.05)。结论VA可以通过降低线粒体自噬及增加线粒体DNA拷贝数影响呼吸道上皮细胞线粒体功能。

NLRX1对低氧诱导的小胶质细胞极化的影响

背景研究表明急进海拔4000 m以上高原低氧地区脑水肿发生率明显增加,小胶质细胞极化介导许多中枢神经系统炎性反应过程,NOD样受体家族X1(NOD-like receptor family X1,NLRX1)蛋白是一种炎症反应的负性调控因子;目前,低氧及NLRX1对小胶质细胞极化的调节作用尚不清楚。目的分析低氧对小胶质细胞极化和NLRX1蛋白表达的影响,探讨NLRX1是否参与了小胶质细胞极化。方法将小鼠小胶质细胞BV-2按处理条件分为3组:对照组(21%O_(2),5%CO_(2),37℃),实验组(1%O_(2),5%CO_(2),37℃处理6 h、12 h、24 h、48 h),M1型极化阳性对照组(LPS 1μg/mL处理24 h)。干扰NLRX1基因的BV-2细胞分为3组:BV-2 sh-Control常氧组(21%O_(2),5%CO_(2),37℃),BV-2 sh-Control低氧组(1%O_(2),5%CO_(2)37℃处理6 h、24 h、48 h),BV-2 sh-NLRX1组(1%O_(2),5%CO_(2)37℃处理6 h、24 h、48 h)。相差显微镜观察细胞形态变化;CCK-8测定细胞活力;流式细胞术检测小胶质细胞极化分型;RT-PCR分析TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10及TGF-β的mRNA水平;蛋白免疫印迹测定NLRX1蛋白水平。结果低氧培养及LPS处理可见细胞突起变多变短,阿米巴样形态细胞增多;细胞活力在低氧2 h和6 h组增加,而在低氧12 h、24 h、48 h及LPS组降低(F=459.1,P<0.05);与对照组相比,低氧培养48 h后,CD11b^(+)+CD86^(+)M1型小胶质细胞百分比下降,CD11b^(+)+CD86^(+)+CD206^(+)M1和M2混合型细胞百分比升高,CD11b^(+)+CD206^(+)M2型小胶质细胞比例均无明显变化;随低氧时间延长,促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β基因的mRNA水平逐渐降低(P<0.05)并在24 h达到最低,而抗炎因子IL-10基因的mRNA水平升高(F=11.38,P<0.05);NLRX1蛋白水平随低氧时间延长而升高;与sh-Control常氧组相比,sh-Control低氧组IL-1βmRNA水平下降(P<0.05),IL-10 mRNA水平低氧处理6 h和48 h均上升;与sh-Control低氧组相比,sh-NLRX1组低氧处理后IL-1βmRNA水平在24 h和48 h下降(P<0.05),IL-10 mRNA水平低氧处理后均下降(P<0.05)。结论低氧可上调NLRX1蛋白水平并减少小胶质细胞M1型极化,该过程可能通过NLRX1下调抗炎因子介导。

大流域汇水雨水系统设计要点分析

以晋江市桥山路雨水系统为例,详细介绍了在大流域汇水面积下雨水汇水流量的计算方法和校核方式,管(涵)末端淹没出流壅水位差的计算,管(涵)出水口的设计方式等方面的内容,为市政雨水系统的设计提供了借鉴。

神经元线粒体转录因子A对缺血性大鼠脑卒中的作用

目的明确神经元线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)对缺血性大鼠脑卒中的作用.方法通过线栓法建立大鼠右侧缺血性脑卒中模型;采用qPCR及Westernblot法测定脑卒中后TFAM基因及蛋白的变化;通过流式细胞术检测线粒体膜电位及神经元凋亡水平.结果①qPCR分析显示,缺血2h MCAO组TFAM的mRNA表达较两对照组高(P<0.05),缺血6h时最低(P<0.05),12 h时表达稍增加,但与6h结果无显著性差异.②Western blot分析显示,缺血2h MCAO组TFAM表达较两对照组高(P<0.05),缺血6h时最低(P<0.05),缺血12 h时,TFAM的表达高于两对照组.③流式细胞术分析显示,缺血2h MCAO组线粒体膜电位下降和凋亡水平较两对照组明显(P<0.05),缺血6h时线粒体膜电位逐渐恢复,凋亡水平降低,12 h线粒体膜电位较6h降低,凋亡水平升高.结论脑缺血2h时TFAM的表达水平可能因应激作用增加,但并不能抑制神经元线粒体膜电位的降低和神经元的早期凋亡;脑缺血6h后,TFAM的转录可能因神经元坏死而受到影响,TFAM表达逐渐稳定,在神经元损伤时对维持神经元线粒体膜电位状态及神经元凋亡水平可能起了一定作用.

重力污水管道入廊设计要点分析

文中以马銮湾中心岛片区综合管廊污水入廊为例,详细介绍了重力污水管道入廊的条件、管廊断面的形式、竖向、检查井、管材及通气等方面的内容,以此为重力污水管道入廊的设计提供借鉴。

油酸对非酒精性脂肪肝细胞活性氧、周期及凋亡的影响

目的研究油酸对非酒精性脂肪肝细胞活性氧、周期及凋亡的影响。方法处理组用60μg/ml油酸处理小鼠正常肝细胞AML-1224、48、72h,对照组不作任何处理。检测细胞培养后上清甘油三酯、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶生化指标,油红O染色观察非酒精性脂肪肝细胞脂滴形成。EdU染色观察肝细胞增殖,利用流式细胞术检测肝细胞ROS、周期及凋亡。结果在24、48及72h时,处理组甘油三酯含量比对照组高(P<0.05)。天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶24、48h结果变化比较,差异无统计学意义(P>0.05),在72h时升高(P<0.05)。油红O染色显示脂滴形成明显(P<0.05)。油酸处理72h后EdU染色显示进入S期细胞增多(P<0.05)。流式结果显示ROS比对照组升高(P=0.000),G 0/G 1期细胞降低(P<0.01),S期细胞数量增多(P<0.05),G 2/M期没有变化(P>0.05),同时肝细胞凋亡比对照组高(P=0.000),坏死比对照组高(P<0.01)。结论非酒精性脂肪肝细胞油酸的代谢产生大量ROS,可能使细胞阻滞在S期,促使了肝细胞的凋亡和坏死。

大鼠感染泡球蚴后外周血及脾脏中滤泡辅助T淋巴细胞的变化

目的分析泡球蚴感染宿主后外周血和脾脏中滤泡辅助T淋巴细胞(Tfh)水平与包虫病进展的关系。方法20只SD大鼠随机分为正常对照组和模型组,每组10只,模型组开腹直视下在右肝接种约2000个原头节,对照组不做任何处理,3个月后麻醉处死SD大鼠,取外周血和脾脏细胞,以CD4^(+)CXCR5^(+)PD1^(+)为Tfh细胞的标记,使用流式细胞术检测外周血和脾脏中Tfh细胞的水平。使用t检验比较两组之间Tfh细胞的差异。结果大鼠感染泡球蚴3个月后,肝脏可见明显病灶,HE染色显示病灶中可见原头节。泡球蚴感染模型组外周血中CD4^(+)CXCR5^(+)PD1^(+)Tfh细胞在CD4+细胞中的平均占比为25.63%±3.47%,正常对照组为11.12%±2.94%,2组比较差异有统计学意义(t=10.230,P<0.001),模型组CD4^(+)CXCR5^(+)PD1^(+)Tfh细胞在所有细胞中所占的比例较正常对照组下降显著(0.08%±0.02%vs 0.18%±0.05%,t=5.520,P<0.001);在所有细胞中,模型组脾脏中CD4^(+)CXCR5^(+)PD1^(+)Tfh细胞所占的比例(3.00%±0.42%)显著低于正常对照组(5.30%±1.40%)(t=4.769,P<0.001)。结论外周血中Tfh细胞与包虫病进展密切相关,有望成为反应泡球蚴感染的指标。

蛋白磷酸酶4在缺血性脑卒中大鼠肝、脑组织中的差异表达

目的探讨蛋白磷酸酶(PP)4在缺血性脑卒中大鼠肝、脑组织中的表达是否存在差异。方法45只健康雄性SD大鼠随机分为正常(NORMAL)组、假手术(SHAM)组、大脑中动脉阻塞(MCAO)组各15只,MCAO组再分为MCAO-2 h组、MCAO-6 h组、MCAO-12 h组3个亚组(各5只)。通过改良线栓法建立MCAO模型模拟缺血性脑卒中。采用尼氏染色观察脑组织形态学改变;经qPCR及Western印迹测定脑卒中后PP4 mRNA及蛋白水平的变化。结果尼氏染色显示MCAO组梗死区尼氏小体数量减少,随时间延长,尼氏小体数量递减,NORMAL组和SHAM组未见明显异常;MCAO-2 h组、MCAO-6 h组、MCAO-12 h组脑组织PP4C mRNA水平较NORMAL组显著降低(P<0.05,P<0.001);MCAO-2 h组肝组织PP4C mRNA水平较NORMAL组显著升高(P<0.001);MCAO-2 h、MCAO-6 h组脑肝组织PP4R2蛋白水平较NORMAL组显著降低(P<0.001,P<0.01);MCAO-2 h组、MCAO-6 h组、MCAO-12 h组肝组织PP4R2蛋白水平较NORMAL组显著升高(P<0.01);除MCAO-12 h组肝组织PPX蛋白水平较NORMAL组显著降低(P<0.01)外,各组脑组织、肝组织PPX蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论PP4在缺血性脑卒中肝、脑组织表达存在差异,提示可能参与了缺血性脑卒中缺氧的适应。

HPLC法同时测定乙肝解毒胶囊中黄芩苷和盐酸小檗碱的含量

建立一种同时测定乙肝解毒胶囊中黄芩苷和盐酸小檗碱含量的HPLC法。以Hypersil BDSC18为色谱柱;以A（乙腈）,B[乙腈-0.5%三乙胺溶液（用磷酸调pH=2.5）（10∶90）]为流动相;采用梯度洗脱程序;流速为1.0mL·min-1;柱温为室温;检测波长为265nm。黄芩苷和盐酸小檗碱的线性范围分别为45.72~274.32μg·mL-1（r=0.9999）,1.930~96.48μg·mL-1（r=0.9995）;加样回收率分别为97.84%（RSD=1.33%,n=6）和100.38%（RSD=1.81%,n=6）。本方法快速、准确、重现性好,可以为乙肝解毒胶囊的质量控制提供依据。

多房棘球蚴对巨噬细胞糖代谢表型转变及极化类型影响的初步研究

目的探讨多房棘球蚴对巨噬细胞糖代谢表型转变、极化类型及炎症反应的影响,为多房棘球蚴病发病机制研究提供参考。方法分离6~8周龄C57BL/6J小鼠骨髓细胞,用小鼠巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony⁃stimulat⁃ing factor,M⁃CSF)诱导成骨髓巨噬细胞(bone marrow⁃derived macrophage,BMDM)⁃M0(对照组);以BMDM⁃M0经白细胞介素(interleukin)⁃4诱导24 h后的M2型巨噬细胞作为IL⁃4诱导组,以BMDM⁃M0与2.4 ng/mL多房棘球蚴囊液(cystic fluid,CF,)共培养的细胞作为BMDM与多房棘球蚴CF共培养组,以BMDM⁃M0与多房棘球蚴原头节(protoscolex,PSC)按500∶1共培养的细胞作为BMDM与PSC共培养组。采用流式细胞术分析与多房棘球蚴CF、PSC共培养后的巨噬细胞极化类型,用实时荧光定量PCR(fluorescent quantitative real⁃time PCR,qPCR)、Western blotting分析其标志物、炎症因子、糖代谢相关酶的表达水平,并通过细胞能量代谢分析各组细胞葡萄糖代谢表型。结果4组细胞精氨酸合酶1(arginase⁃1,Arg1)(F=1457.00,P<0.0001)、巨噬细胞衍生趋化因子22(macrophages⁃derived C⁃C motif chemokine 22,Ccl22)(F=22203.00,P<0.0001)、抵抗素样α(resistin⁃likeα,Retnla)(F=151.90,P<0.0001)、诱导型一氧化氮合酶(induc⁃ible nitric oxide synthase,iNOS)(F=107.80,P<0.001)、己糖激酶(hexokinase,HK)(F=9389,P<0.0001)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)(F=641.40,P<0.0001)、磷酸果糖激酶1(phosphofructokinase1,PFK1)(F=43.97,P<0.01)、葡萄糖激酶(glucokinase,GK)(F=432.50,P<0.0001)、丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinases,PDK1)(F=737.30,P<0.0001)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)(F=3632.00,P<0.0001)、葡萄糖转运体1(glucose trans⁃porter 1,GLUT1)(F=532.40,P<0.0001)、甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶(glyceraldehyde⁃3⁃phosphate dehydrogenase,GAPDH)(F=460.00,P<0.0001)、柠檬酸合酶(citrate synthase,CS)(F=5642.00,P<0.01)、糖原合成酶1(glycogen synthase 1,GYS1)(F=273.30,P<0.0001)、IL⁃6(F=1823,P<0.0001)、IL⁃10(F=291.70,P<0.0001)、IL⁃1β(F=986.60,P<0.0001)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)⁃α(F=334.80,P<0.0001)、转化生子因子(transforming growth fac⁃tor,TGF)⁃β(F=163.30,P<0.001)mRNA表达水平差异均有统计学意义。BMDM与多房棘球蚴PSC共培养组M2型巨噬细胞比例(22.87%±1.48%)高于M1型巨噬细胞(1.70%±0.17%)(t=24.61,P<0.001),BMDM与多房棘球蚴CF共培养组M2型巨噬细胞比例(20.07%±0.64%)高于M1型巨噬细胞比例(1.93%±0.25%)(t=45.73,P<0.001)。与对照组相比,BMDM与多房棘球蚴CF共培养组、BMDM与多房棘球蚴PSC共培养组M2型巨噬细胞标志物Arg1、Ccl22、Retnla mRNA表达水平均升高(P均<0.01),而M1型巨噬细胞标志物iNOS mRNA表达水平无明显变化(P>0.05),糖酵解关键酶HK、PK、PFK mRNA表达水平升高(P均<0.01),炎症因子IL⁃10、IL⁃1β、TNF⁃α、TGF⁃βmRNA表达水平升高(P均<0.01)。此外,与对照组相比,BMDM与多房棘球蚴PSC共培养组HK、PK、PFK蛋白表达水平,GLUT1、GAPDH、IL⁃6 mRNA表达水平均升高(P均<0.05);BMDM与多房棘球蚴CF共培养组HK蛋白表达水平升高(P<0.05);IL⁃4诱导组HK、PK、PFK蛋白及mRNA表达水平均升高(P均<0.01),IL⁃6、TNF⁃αmRNA表达水平均降低(P均<0.05),TGF⁃βmRNA表达水平升高(P<0.01)。糖酵解压力测试显示,对照组、IL⁃4诱导组、BMDM与多房棘球蚴PSC共培养组细胞外酸化率(extra cellular acidification rate,ECAR)差异有统计学意义(F=124.4,P<0.05);与对照组相比,BMDM与多房棘球蚴PSC共培养组ECAR增高,IL⁃4诱导组ECAR降低(P均<0.05)。结论多房棘球蚴CF/PSC处理使BMDM主要向M2型极化,糖代谢向高能量、高糖酵解代谢表型转变,并影响其炎症反应。

多房棘球蚴感染对巨噬细胞线粒体功能的影响

目的观察多房棘球蚴感染后巨噬细胞线粒体代谢功能变化,为探索多房棘球蚴病发病机制提供依据。方法根据处理方法不同设培养组和对照组,其中培养组按照500∶1比例将小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)与2 000个多房棘球蚴共培养,对照组RAW264.7细胞不做任何处理。根据培养时间不同,将对照组和培养组分为24 h对照组、72 h对照组、24 h培养组、72 h培养组。采用Mito Tracker;Deep Red FM线粒体深红色荧光探针标记线粒体并应用Cytation5细胞成像微孔板检测系统检测细胞线粒体平均荧光强度,用实时荧光定量PCR检测线粒体DNA拷贝数(mitochondrial DNA copy number,mt DNA-CN),采用Seahorse细胞能量代谢系统实时监测线粒体能量代谢功能,采用流式细胞术检测线粒体活性氧及线粒体膜电位。结果 24 h(15.341±2.532 vs. 17.823±3.429;t=6.379,P <0.01)、72 h(18.102±3.505 vs. 21.511±5.144;t=17.680,P <0.01)培养组线粒体平均荧光强度均较其相应对照组显著降低。72 h培养组mt DNA-CN(3.23×10^(9)±1.78×10^(7))较其对照组(4.39×10^(9)±3.70×10^(7))显著降低(t=8.85,P <0.001)。实时线粒体能量代谢功能分析结果示,24 h [(241.70±73.13) pmol/min vs.(69.05±52.30)pmol/min;t=7.89,P <0.01]、48 h [(249.50±42.06)pmol/min vs.(60.28±40.66)pmol/min;t=8.64,P <0.01]培养组较相应对照组细胞耗氧率升高,且48 h培养组细胞外酸化率较其对照组增高[(111.60±17.49) mp H/min vs.(35.05±7.57)mp H/min;t=16.90,P <0.01];72 h培养组较其对照组线粒体活性氧平均荧光强度显著升高(58 264±10 087 vs. 4 307±97;t=12.930,P <0.01)、线粒体膜电位显著降低(9.833%±2.285% vs. 2.667%±0.208%;t=6.645,P <0.01)。结论多房棘球蚴感染可损伤巨噬细胞线粒体功能、抑制巨噬细胞氧化磷酸化过程而使糖酵解增强,巨噬细胞代谢状态改变可能是多房棘球蚴病发生和发展的机制之一。