不同分子量壳聚糖对罗非鱼片冷藏保鲜作用的研究

以罗非鱼片为原料,探讨了壳聚糖分子量对罗非鱼片冷藏保鲜效果的影响。以感官评分、细菌总数、p H、挥发性盐基氮（TVB-N值）、鲜度指标（K值）等作为罗非鱼片保鲜评价指标,研究了罗非鱼片在4℃冷藏时的品质变化。结果表明,在冷藏保鲜期间,经过壳聚糖处理的罗非鱼片感官评分值下降缓慢,细菌总数、p H、TVB-N值、K值均低于对照实验组。经过壳聚糖处理的罗非鱼片能够延长保质期1-3 d,并且分子量较小的壳聚糖（4 ku）对罗非鱼片的保鲜效果较好。

血管生长素对缺血心肌促血管生长作用的初步观察

目的 :探索血管生长素 (angiogenin,ANG)对缺血性心肌的促血管生长作用 ,以评价其应用于生物治疗的可行性。方法 :以先期成功表达的基因重组人血管生长素衍生物 Asp116 His对心肌梗死模型兔的缺血心肌边缘部作直接心肌内注射。注射后 8d行冠状动脉血管造影 ,并取注射点心肌切片作常规病理苏木精 -伊红染色、VB染色、 因子相关抗原免疫组化标记。结果 :用药组兔心脏表面注射点周围心肌缺血情况较对照组明显减轻 ,镜检可见心肌间质内有大量小血管 ,免疫组化标记发现心肌纤维间毛细血管数明显增多。结论 :首次证实了 ANG在心脏冠状血管内存在有效作用位点 ;ANG有可能成为缺血心肌再血管化生物治疗因子。

人血管生长素衍生物的重组腺病毒制备

目的 :构建并鉴定血管生长素 (ANG)衍生物重组腺病毒 ,为心肌缺血区促血管生长因子基因转染研究作准备。方法 :ANG衍生物 D116 H - ANG重组粘粒与腺病毒 DNA末端肽复合物混合后以磷酸钙共沉淀法转染 2 93人胚肾细胞株细胞。结果 :酶切结果显示 ,重组粘粒中 ,D116 H - ANG插入方向正确 ,所获重组腺病毒带有 ANG衍生物基因。结论 :所获重组腺病毒为 E1 ,E3缺陷型 。

血管内皮细胞生长因子基因转染诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为内皮细胞

目的:评价经腺病毒介导的血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染后的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导成内皮细胞的可行性。方法:从大鼠骨髓中分离培养获取BMSCs,分别经Adv-VEGF、Adv-GFP转染,Western印迹分析检测VEGF蛋白的表达情况,细胞生长曲线测定BMSCs增殖特性,同时进行免疫表型鉴定,并与未转染细胞组比较。结果:AdvVEGF转染组BMSCs可分泌VEGF蛋白,而其余两组不分泌VEGF蛋白。转染VEGF基因后,BMSCs生长速度变快,向内皮细胞分化。与Adv-VEGF转染组BMSCs相比,Adv-GFP转染细胞组、未转染细胞组的BMSCs生长速度较慢,未有向内皮细胞分化的证掘。结论:腺病毒介导的VEGF基因转染可诱导BMSCs分化成内皮细胞。

重组腺病毒介导的血管生成素改善缺血性心脏病的实验研究

目的观察重组腺病毒介导的血管生成素促进慢性缺血心肌血管生成,并改善心肌血流灌注和心功能的有效性。方法置Ameriod环建立猪慢性心肌缺血模型,并随机分为3组,血管生成素腺病毒组,空病毒组,对照组。分别心内注射腺病毒介导的血管生成素基因、空病毒和生理盐水。通过冠状动脉造影、心脏超声、核磁心肌灌注成像、病理学观察等评价血管生成素的治疗效果。结果置环后的猪均为有效的动物模型。注射血管生成素的缺血心肌模型侧支血管增生明显,血管计数增加,Rentrop分数、面积变化分数改善,梗死区缩小,缺血区血管密度增高尤其是内皮细胞、平滑肌细胞增加,凋亡细胞减少、细胞之间的黏附性增加。结论腺病毒介导的血管生成素基因治疗缺血性心脏病可明显改善心功能,使局部血液循环明显改善。

腺病毒介导RNA干扰抑制血管内皮生长因子的表达治疗人肺腺癌的实验研究

目的:构建针对人血管内皮生长因子(VEGF)的腺病毒载体pAd-Easy/VEGF,应用RNA干扰的方法,观察其在体内和体外对人肺腺癌细胞株A549生长的抑制作用。方法:应用PCR构建RNA干扰pAd-Easy/VEGF腺病毒载体,并利用该线性化质粒用Lipofectamine2000转染293细胞,制备携带人VEGF的腺病毒转染A549细胞。荧光显微镜和流式细胞仪观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的转染效率,RT-PCR和蛋白质印迹法检测VEGFmRNA的表达,MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线。同时制备裸鼠A549细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况。结果:pAd-Easy/VEGF重组质粒经测序证实已把预设人VEGF基因RNA干扰的siRNA模板序列插入载体。转染重组腺病毒及空病毒24h后流式细胞术测得转染效率分别为100%、99.7%。pAd-Easy/VEGF组VEGF表达水平较生理盐水对照组明显降低。pAd-Easy/VEGF组细胞生长明显减缓。pAd-Easy/VEGF治疗组肿瘤体积和质量明显小于对照组(P<0.01)。结论:pAd-Easy/VEGF介导的VEGFshRNA能有效抑制A549细胞中VEGF的表达,并在体内抑制肿瘤生长。

红细胞免疫调控机理研究新进展

红细胞免疫调控是一个较新的研究领域。近来,国内外学者做了大量的工作,对红细胞在机体免疫调节中所起的作用进行了较全面的研究。发现红细胞存在有许多与免疫功能有关的物质,如CR_1、CR_3、LFA-3、DAF 及SOD 酶等。红细胞通过这些免疫物质参与循环免疫复合物的清除,调节补体活性,调控淋巴及吞噬细胞的免疫功能。此外,红细胞还可以对一些较小的抗原物质直接进行杀伤,增强其抗原性,调节并增强其他细胞的免疫应答。本文就上述研究进展及其意义进行了归纳介绍。

人血管形成素腺病毒重组粘粒构建

血管形成素(angiopoietin,ANG)是一种新近发现的与血管生长密切相关的生物因子,目前已发现有两种分型,即和型血管形成素(ANG,ANG2)[1,2]。其中型血管形成素具有很强的促进血管内皮细胞增殖和血管形成的作用[3],其编码基因位于染色体的8q22.3-q23区,受体为Tie-2。体内外实?..

壳聚糖抗菌活性研究进展

壳聚糖具有无毒、良好的生物相容性、生物可降解性、广谱抗菌性等优良性能,作为新型抗菌剂越来越受学者的青睐。本文主要综述了21世纪以来影响壳聚糖抗菌性能的因素、壳聚糖的抗菌机理以及壳聚糖衍生物抗菌性能等方面的内容。

腺病毒介导的可溶性Ⅰ型补体受体基因转染对急性心肌缺血的保护作用的实验研究

目的:探讨腺病毒介导的可溶性Ⅰ型补体受体(solub le comp lem ent receptor type 1,sCR1)基因转染对急性心肌缺血的保护作用。方法:开胸阻断小鼠左冠状动脉前降支起始部30 m in后开放,实验组(14只)在开放冠状动脉前5 m in于缺血区注射携带sCR1和LacZ的混合腺病毒液(100μl,1010噬斑形成单位);对照组(13只)注射LacZ腺病毒液(100μl,1010噬斑形成单位)。术后2周时利用超声心动图检查心功能,并于检查后立即取标本行病理检查。结果:术后2周时,各项超声指标实验组都明显优于对照组(P<0.05);尤其是反映梗死范围大小的梗死范围率,差异非常显著(P<0.01)。病理检查见实验组动物心肌梗死区域小于对照组,H-E染色显示实验组注射sCR1腺病毒的范围内存活心肌细胞明显多于对照组。结论:缺血心肌再灌注前注射sCR1腺病毒可以明显减小梗死范围,提高远期心脏功能。

可溶性Ⅰ型补体受体活性区基因的突变修正

目的:修正可溶性型补体受体(sCR1)PCR过程中造成的碱基突变,保证基因序列氨基酸编码的准确性,为蛋白表达和基因转染打下基础。方法:采用掺尿苷寡聚核苷酸介导的定点突变法,对sCR1活性区基因中错配的碱基加以修正,用点杂交方法筛选突变子阳性克隆,测序鉴定。结果:40℃洗膜,放射自显影示除阴性对照和1个样品外,阳性对照和其余19个克隆均显阳性黑斑;56℃洗膜,放射自显影示5个样品为阳性。阳性克隆测序结果正确。结论:掺尿苷寡聚核苷酸介导的定点突变法是一种快速而可靠的DNA突变修正方法,但仍存在较高的假阳性,点杂交有助于阳性克隆的筛选。

深低温停循环经右锁骨下动脉持续脑灌注的实验研究

目的:研究深低温停循环(DHCA)时经右锁骨下动脉持续脑灌注对脑组织的保护效果。方法:36只杂种猫随机分为3组(n=12)。组Ⅰ:单纯DHCA 90 min。组Ⅱ:DHCA+经上腔静脉逆行脑灌注90 min。组Ⅲ:DHCA+经右锁骨下动脉脑灌注90 min。检测各组脑组织超微结构变化及颈静脉血氧饱和度、颈静脉血乳酸含量、脑组织ATP含量。结果:复温后组Ⅰ颈静脉血氧饱和度为(61.7±7.0)%,低于组Ⅱ(69.0±6.1)%和组Ⅲ(71.2±5.5)%(P<0.05)。光镜、电镜下组Ⅱ和组Ⅲ脑组织缺血、缺氧改变均显著轻于组Ⅰ,且组Ⅲ优于组Ⅱ。复温开始和复温完全后组Ⅱ乳酸含量为(7.36±0.44)mmol/L及(7.24±0.38)mmol/L;组Ⅲ为(6.88±0.30)mmol/L及(7.02±0.27)mmol/L,均低于组Ⅰ的(11.88±0.58)mmol/L及(11.59±0.57)mmol/L(P<0.01)。复温后,组Ⅱ、组ⅢATP含量分别为(1.72±0.21)μmol/g、(2.02±0.19)μmol/g,均高于组Ⅰ的(1.08±0.24)μmol/g(P<0.01),且组Ⅲ高于组Ⅱ(P<0.05)。结论:深低温停循环经右锁骨下动脉持续脑灌注更有利于脑组织的氧供需平衡,可以避免严重的脑缺血性损伤和保持满意的脑能量代谢水平。

重组人纤维连接蛋白羧基端细胞结合域单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备人纤维连接蛋白(fibronectin,FN)羧基端细胞结合域的单克隆抗体,并以该抗体检测心脏瓣膜基质蛋白中FN蛋白的表达情况。方法:用RT-PcR方法获取人FN羧基端细胞结合域基因序列,通过pET32质粒表达获得TRX融合蛋白。并以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB／c小鼠后,按常规方法制备成单克隆抗体,获得分泌抗FN单克隆抗体的杂交瘤细胞株。结果:蛋白电泳结果显示,所获TRX融合蛋白条带与理论计算值相符,免疫动物后获得2株分泌抗FN羧基端细胞结合域不同位点单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体亚型为IgC2a,免疫组化显示该抗体能特异性地结合人心脏瓣膜基质中的FN。结论:成功制备了分泌抗FN单克隆抗体,为FN结构、功能和机制的研究提供了有效工具。

人血管内皮生长因子-D的重组腺病毒制备与鉴定

生物旁路是近年来缺血性心脏病治疗研究的一个新热点。本研究旨在构建人血管内皮生长因子 D重组腺病毒 ,为基因转染研究作准备。用重组粘粒和DNA TPC混合后 ,以磷酸钙共沉淀法转染 2 93细胞 ,获取重组腺病毒。重组粘粒插入方向及重组腺病毒均经酶切鉴定为正确。所得重组腺病毒为E1缺陷 ,可用于体内基因治疗研究。

应用p75^NTR分选食管肿瘤干细胞并鉴定其生物学特性

目的:应用p75NTR进行人食管肿瘤干细胞的分选,并对其生物学特性进行鉴定。方法:对人食管癌标本癌细胞及食管癌细胞株TE-1、Eca109进行培养,应用流式细胞仪检测p75NTR在人食管癌细胞(esophageal cancer cells,ECCs)中的表达,应用磁珠分选(MACS)法进行p75NTR阳性细胞与阴性细胞的分选,观察p75NTR阳性细胞的增殖、分化及软琼脂克隆形成能力,并进行裸鼠接种以观察其致瘤能力;应用化疗药物作用于ECCs后检测其中p75NTR阳性细胞与阴性细胞存活率,以评价p75NTR阳性细胞对化疗药物的耐受性。结果:8个食管肿瘤细胞系(株)中,除SHEC-1、SHEC-5未检测到p75NTR阳性细胞外,其余6个细胞系(株)SHEC-4、SHEC-6、SHEC-7、SHEC-8、Eca109、TE-1中均检测到p75NTR阳性细胞,阳性细胞比例分别为2.71%、0.32%、3.35%、1.13%、2.15%、0.45%。与阴性及未分选细胞相比,MACS分选后的p75NTR阳性细胞具有较强的增殖能力,具有分化产生其他表型细胞的能力,在软琼脂中具有较强的克隆形成能力(P<0.01);行裸鼠接种时,p75NTR阳性细胞表现出较强的致瘤性,其中SHEC-7细胞只需2×103个即可致瘤,其致瘤能力是未分选细胞的50倍。化疗药物分别作用于p75NTR阳性细胞与阴性细胞48h后,p75NTR阳性细胞的存活比例明显高于阴性细胞(P<0.05)。结论:人食管肿瘤细胞中p75NTR阳性细胞具有自我更新、分化、增殖能力,对化疗药物具有较强的耐受性,并具有较强的致瘤能力,具有肿瘤干细胞的特性。

组织工程心脏瓣膜体外脉动反应器的初步研制

目的:探讨自行研制的体外脉动反应器应用于组织工程心脏瓣膜应力预适应的可行性。方法:根据流体力学原理,采用特殊材料自行设计制作了体外脉动反应器和预适应应力培养系统;将生物瓣置于反应器中运转,观察生物瓣的工作状态和系统的稳定性。以脱细胞猪主动脉瓣作支架,新生牛主动脉内皮细胞作种子细胞构建组织工程心脏瓣叶,静态培养4 d后,置入反应器内进行预适应处理24 h(流量由30 ml/min调至400 ml/min,频率30次/min),观察内皮细胞残留情况,并与静态培养的瓣膜相比较。结果:预适应应力培养系统能产生搏动性液体流,生物瓣正常工作,运转7 d,系统状态稳定。静态培养成功构建组织工程心脏瓣膜,内皮细胞与瓣叶支架黏附紧密,沿瓣叶表面形成单层细胞层,生长状态良好;动态培养的瓣叶内皮细胞部分被冲刷脱落,但仍有少部分细胞(6.26％)残留黏附。结论:自行设计和构建的体外脉动反应器基本能模拟体内心脏瓣膜的血流动力学,用于组织工程心脏瓣膜预适应研究具有可行性。

血府逐瘀胶囊对急性心肌梗死再灌注后心肌及内皮素-1、一氧化氮/一氧化氮合酶体系影响的实验研究

目的:观察血府逐瘀胶囊对急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)再灌注后心肌组织及一氧化氮(nitric oxide,NO)/一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)体系和内皮素-1(endothelin-1,ET-1)的影响,探讨其改善血管内皮功能的机制。方法:Yorkshire猪45只,随机分成假手术组、模型对照组和血府逐瘀胶囊治疗组。开胸结扎左冠状动脉前降支90min后,松解2h制备AMI再灌注模型。测定造模前后和再灌注后血清ET-1和NO的含量;冠状动脉造影观察心肌血流恢复情况;Western blot分析心肌组织内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)和ET-1蛋白表达;病理学分析心肌组织形态变化。结果:血府逐瘀胶囊组造模后和再灌注后血ET-1水平低于模型组(P<0.01),而NO表达水平明显高于模型组(P<0.01)。冠状动脉造影提示治疗组冠状动脉血流通畅情况优于对照组,但结果没有统计学意义(P=0.253)。Western blot显示血府逐瘀胶囊组eNOS蛋白表达较模型组有所提高,ET-1蛋白表达则有所下降(P<0.01)。HE染色及微血管密度分析显示与模型对照组相比,血府逐瘀胶囊组毛细血管扩张程度明显减轻,心肌组织损伤明显改善,微血管密度明显增加。结论:内皮细胞受损可能是无再流现象发生的重要机制之一,血府逐瘀胶囊可能通过调控NO和ET-1基因表达来达到对AMI的治疗作用。

三种去细胞方法构建的猪主动脉瓣膜支架的性能比较

目的:评价不同去细胞方法制备的猪主动脉瓣支架的组织学、生物力学特性及组织相容性,寻找更合适的去细胞心脏瓣膜支架制备方法。方法:分别采用3种不同的去细胞方法对新鲜猪主动脉瓣叶及带瓣主动脉管道进行脱细胞处理:0.01%胰蛋白酶+1%Triton+核酸酶组用含有0.01%胰蛋白酶-1%Triton和核酸酶的去细胞溶液37℃持续震荡24h;0.01%胰蛋白酶8h+1%脱氧胆酸(DCA)+核酸酶组先用0.01%胰蛋白酶37℃持续震荡消化处理8h,终止胰酶后加入含有1%DCA和核酸酶的去细胞溶液37℃持续震荡24h;1%DCA+核酸酶32h组:用含有1%DCA和核酸酶的去细胞溶液37℃持续震荡32h;同时以PBS漂洗的新鲜瓣叶作为对照组。通过H-E染色、扫描电镜和透射电镜观察评价去细胞效果。测定瓣叶弹性模量、最大抗张强度、应力伸长比及断裂伸长比以评价各组瓣叶的生物力学特性。大鼠皮下包埋实验评价去细胞支架的免疫源性、体内炎性反应及改建情况。结果:0.01%胰蛋白酶8h+1%DCA+核酸酶组细胞去除完全,优于0.01%胰蛋白酶+1%Triton+核酸酶组和1%DCA+核酸酶32h组。所制备瓣膜支架的弹性模量及最大抗张强度大于0.01%胰蛋白酶+1%Triton+核酸酶组。应力伸长比及断裂伸长比则小于0.01%胰蛋白酶+1%Triton+核酸酶组,与新鲜瓣叶无明显差异。体内埋植实验炎症反应轻微,宿主成纤维细胞能够长入支架并对其进行改建。结论:短时间低浓度胰蛋白酶与1%DCA和核酸酶相结合的去细胞法方便有效,既能完全去除猪带瓣主动脉管道的细胞成分,使免疫源性显著下降;同时瓣叶的生物力学特性保持稳定,可为受体细胞化组织工程心脏瓣膜的提供可靠的支架材料。

β－内啡呔对红细胞免疫功能调节的实验研究

对β－内啡呔红细胞免疫调节作用做了系列研究，发现高浓度β－内啡呔有抑制作用，而低浓度β－内啡呔有促进作用。这种作用可被纳络酮或抗ＣＲ＿１单抗所阻断，对其作用机制作了初步探讨。