核糖核酸的m6A甲基化水平及主要甲基化调控酶在糖尿病肾病足细胞损伤中的表达和作用

目的明确糖尿病肾病(DN)足细胞损伤中RNA m6A甲基化修饰的改变,探索可能起主要调控作用的甲基化修饰酶。方法2型DN db/db小鼠(DN组)和非DN db/m小鼠(对照组),每组各6只饲养至32周后提取肾小球。采用比色法检测各组小鼠肾小球RNA m6A甲基化水平,RT-PCR检测小鼠肾小球中主要甲基化调控酶(METTL3、METTL14、WTAP、FTO和ALKBH5)的表达,采用免疫组织化学(简称免疫组化)法观察甲基转移酶METTL14在各组小鼠肾组织的表达。选取微小病变(MCD)和DN患者肾穿刺和肾癌患者癌旁健康肾组织标本,采用免疫组化法检测METTL14和WT1在各组组织中的表达。采用免疫印迹RT-PCR和免疫印迹检测体外梯度浓度高糖(25、35 mmol/L)或AGE(25、50、100μmol/L)刺激的人足细胞内METTL14的mRNA和蛋白质相对表达量。采用免疫荧光明确METTL14在50μmol/L的AGE处理下的人足细胞中的表达和定位。体外应用METTL14小干扰RNA处理人足细胞并予AGE刺激24 h。采用免疫印迹检测法检测各组足细胞内METTL14和凋亡蛋白表达,RT-PCR检测各组足细胞趋化因子和炎症因子的mRNA水平。结果与对照组比较,DN组小鼠肾小球中RNA的m6A甲基化水平显著增加;DN组小鼠肾小球中甲基转移酶METTL3、METTL14及去甲基化酶FTO的mRNA和蛋白质相对表达量升高,其中METTL14增高最为显著(P值均<0.05)。与健康对照者比较,DN患者肾穿刺样本中足细胞标志物WT1显著减少,METTL14的阳性数目显著增多并定位于细胞核(P值均<0.001)。体外35 mmol/L高糖和50μmol/L AGE刺激显著促进人足细胞内METTL14 mRNA和蛋白质相对表达量(P值均<0.01)。体外转染METTL14小干扰RNA显著抑制了AGE刺激后的人足细胞内METTL14蛋白表达的上调和足细胞凋亡,减轻AGE诱导的人足细胞内趋化因子MCP-1、炎症因子IL-6、TNF-αmRNA水平的增加。结论METTL14可能是介导DN肾小球中RNA的m6A甲基化修饰的关键调控酶。敲除足细胞METTL14可通过减轻足细胞的凋亡和炎症发挥对DN损伤足细胞的保护作用。