POMC神经元Isl1基因条件性敲除小鼠模型构建及表型分析

目的构建POMC神经元上Isl1基因条件性敲除小鼠模型,并初步分析其表型。方法利用Cre/loxP系统构建条件性基因敲除小鼠模型,通过Isl1flox/+自交获得Isl1flox/flox小鼠,再将Isl1flox/flox小鼠与POMCCre基因型小鼠交配得到POMCCre;Isl1flox/+雄鼠,POMCCre;Isl1flox/+雄鼠再与Isl1flox/flox雌鼠交配,通过PCR进行基因型鉴定,得到POMC神经元上Isl1条件性敲除小鼠(POMCCre;Isl1flox/flox,缩写为Isl1ΔPOMC),免疫印迹法验证其敲除效率。通过功能学及组织病理学方法,观察主要组织器官是否存在自发病变。结果成功构建了Isl1ΔPOMC小鼠,Isl1ΔPOMC小鼠下丘脑弓状核中ISL1敲除效率>90%(P<0.05),其他组织中ISL1表达水平无变化(P>0.05),证明POMC神经元Isl1基因敲除小鼠模型构建成功。Isl1ΔPOMC小鼠呈现青春期后自发性进行性肥胖、代谢综合征及生育能力障碍等表型。结论应用Cre/loxP技术成功构建了POMC神经元Isl1基因条件性敲除小鼠,为研究Isl1在POMC神经元中生物学功能和调控机制提供了重要的动物模型。

雷帕霉素诱导急性T淋巴白血病细胞自噬分子机制的研究

目的:研究不同浓度雷帕霉素对急性白血病CD4+T-Jurkat细胞增殖的影响,并从自噬方面探讨其作用机制。方法:MTT法检测不同浓度雷帕霉素对细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡率和周期阻滞;吖啶橙染色观察自噬溶酶体的变化;转录组测序数据分析自噬相关基因的差异表达;RT-qPCR和Western Blot实验检测自噬相关基因的转录和蛋白质表达水平;FAIRE-qPCR分析自噬基因启动子区的染色质可及性状态。结果:与对照组相比,雷帕霉素呈浓度和时间依赖性方式抑制Jurkat细胞的增殖;并将细胞周期阻滞在G0/G1期,但不能有效诱导细胞凋亡。通过吖啶橙染色观察,给药后可见自噬溶酶体的数量增加。RNA-seq数据显示,雷帕霉素可以显著影响自噬相关基因的转录水平。不同浓度雷帕霉素作用于Jurkat细胞48 h后,10 nmol/L和20 nmol/L浓度的雷帕霉素可上调ULK1、ATG13、ATG16L2、PI3K3R1、Raptor基因的表达,下调MAPK1基因的表达;50 nmol/L时,下调各基因的表达水平。自噬基因启动子区域染色质可及性也随之发生改变,与基因表达变化趋势基本一致。结论:雷帕霉素能够抑制Jurkat细胞的增殖,阻滞细胞周期,诱导细胞发生自噬;较低浓度的雷帕霉素促进自噬相关基因的表达,高浓度则抑制其表达。