莲子心总生物碱及总生物碱高氯酸盐对MG63细胞迁移和迁移体生成的影响

目的 研究莲子心总生物碱(TAL)和总生物碱高氯酸盐(TALP)对MG63细胞迁移及迁移体生成的影响,探讨其治疗骨肉瘤的作用机制。方法 将对数生长期的MG63细胞,分为空白组、TAL组和TALP组,空白组不加药物,TAL组和TALP组以10、20、40、60、80、100μg/mL TAL和TALP培养液分别干预24、48 h后采用CCK8法检测各组细胞增殖率;根据CCK8实验结果,取24 h IC_(50)的一半剂量约为50.0μg/mL稀释成不同浓度的含药培养基来干预细胞,即2组实验组分别加入50.0、25.0、12.5、6.25μg/mL TAL和TALP干预24 h后采用划痕实验检测各组细胞迁移率,并计算迁移抑制率为50%的药物浓度;MG63细胞传代培养15~20 h后采用激光共聚焦显微镜、透射电镜观察细胞迁移体的生成和形态结构;将细胞分成空白组、TAL组和TALP组,后2组根据划痕实验结果,取细胞迁移抑制率约为50%时的药物浓度进行干预15~20 h,计算并比较各组迁移体生成的数量变化。结果 与空白组比较,20、40、60、80、100μg/mL TAL和40、60、80、100μg/mL TALP干预后细胞增殖率均显著下降(P<0.05);TAL和TALP的12.5、25.0、50.0μg/mL组细胞迁移率显著下降(P<0.05),迁移抑制率为50%的药物浓度分别为TAL 15.05μg/mL,TALP 20.16μg/mL;激光共聚焦显微镜观察显示MG63细胞迁移过程中尾部可见膨大的囊泡,透射电镜下观察到囊泡为迁移体石榴样结构;与空白组比较,TAL 15μg/mL组和TALP20μg/mL组迁移体生成的数量显著减少(P<0.05)。结论 TAL和TALP对骨肉瘤细胞迁移有抑制作用,其机制可能与影响细胞迁移体的生成有关。

EDTA脱钙方法的实验观察

骨骼组织是一种坚硬的结缔组织，有机成分类骨质和无机成分骨盐2种成分紧密结合形成骨基质，使其变得十分坚硬，不能直接制片。我们实验工作中要获得一张优质的骨切片，均需脱钙处理，使钙盐溶解，组织变软后才能制作切片。然后进行HE染色、特殊染色和免疫组化等观察。在诸多脱钙方法中，笔者在实践中认为化学螯合物（EDTA）脱钙法是一种较为理想、可行的方法，特别适合科学研究。

健骨颗粒对去卵巢骨质疏松模型鼠钙调节激素的影响

目的探讨健骨颗粒对骨质疏松模型鼠三种主要钙调节激素水平的影响。方法切除雌性大鼠卵巢建立绝经后骨质疏松症病理模型,分别喂服健骨颗粒、骨松宝和生理盐水,用放射免疫测定法检测血清甲状旁腺激素(PTH)、1,25二羟维生素D3[1,25(OH)2D3]、降钙素(CT)和雌二醇(E2)水平。结果卵巢切除后随着血清E2水平的下降,1,25(OH)2D3、CT含量明显下降(P<001或P<005),而PTH却显著上升(P<001)。用药后健骨颗粒组血清1,25(OH)2D3、CT水平显著回升(P<001或P<005),而PTH浓度出现下降(P<001)。E2与CT、1,25(OH)2D3呈正相关,而与PTH呈负相关;PTH与1,25(OH)2D3、CT呈负相关,1,25(OH)2D3与CT呈正相关。结论健骨颗粒能通过协调骨质疏松模型鼠血清PTH、1,25(OH)2D3、CT三种钙调节激素浓度,改善因E2下降对骨代谢产生的副作用,这可能是健骨颗粒有效防治骨质疏松症的主要作用机制之一。

健骨颗粒对去卵巢骨质疏松模型大鼠骨质量的影响

目的 探讨健骨颗粒对骨质疏松模型大鼠骨质量的影响。方法 运用切除大鼠卵巢方法建立去卵巢骨质疏松症模型,应用双能X线骨密度仪测定骨密度;运用不脱钙骨切片、甲苯胺蓝染色观察胫骨上端组织结构并作形态计量;运用光测弹性仪加力架测定第1腰椎压缩强度极限和弹性模量,以及股骨弯曲破坏荷载。结果 健骨颗粒能有效提高模型大鼠骨密度、骨小梁面积和骨皮质厚度/髓腔直径比值,提高椎体骨压缩强度极限和股骨弯曲破坏荷载。结论 健骨颗粒在增加骨质疏松模型大鼠骨密度的同时,能有效改善骨组织的结构状况,提高骨骼生物力学性能,提高骨质量。

健骨颗粒对去卵巢大鼠骨质疏松症预防作用的研究

目的 :探讨健骨颗粒对实验性Ⅰ型原发性骨质疏松症的预防作用。方法 :运用切除大鼠卵巢方法建立去卵巢骨质疏松症模型 ,采用双能X线骨密度测定法和放射免疫分析法等 ,检测实验鼠骨骼密度、血清骨钙素、雌二醇、降钙素水平以及子宫指数。结果 :健骨颗粒可明显升高骨密度和子宫指数 ,提高血清雌二醇、降钙素水平 ,降低骨钙素含量。结论 :健骨颗粒可通过调节机体相关内分泌功能 ,有效协调钙调节激素 ,降低骨的转换率 ,增加骨密度 ,对Ⅰ型原发性骨质疏松有预防或延缓发生的作用。

健骨颗粒对去卵巢骨质疏松模型鼠尿脱氧吡啶酚及骨组织整合素β_1 mRNA表达的影响

目的从分子水平及骨代谢角度探讨健骨颗粒对成骨细胞功能的调控作用以及对骨吸收的影响。方法通过切除大鼠卵巢建立骨质疏松模型,药物干预,分别运用酶联免疫吸附法和原位杂交等手段,检测模型鼠尿脱氧吡啶酚(D-Pyr)水平和骨组织整合素β1(Itgβ1)mRNA表达。结果切除卵巢后模型鼠尿D-Pyr水平明显升高(P<0·01),骨组织成骨细胞Itgβ1mRNA表达降低。健骨颗粒治疗12周,骨质疏松模型鼠尿D-Pyr水平明显下降(P<0·05),而骨组织成骨细胞数量以及Itgβ1mRNA表达均显著增加。结论健骨颗粒通过降低骨质疏松模型鼠骨基质中Ⅰ型胶原纤维的分解代谢,提高成骨细胞的成骨活性,从而改善或扭转因E2下降出现的成骨不足病理态势,发挥“健骨”之功。

比较3种形态学方法观察成骨细胞矿化结节的应用价值

背景:矿化结节是成骨细胞分化成熟的标志,以往观察方法多采用茜素红等特殊染色法。目的:比较茜素红染色-光镜、四环素荧光标记-激光扫描共聚焦显微镜、扫描电镜3种形态学观察成骨细胞矿化结节的方法,分析各自的特点及在骨病研究中的应用价值。方法:将大鼠成骨细胞株UMR-106正常培养、每天换液,连续培养14 d,分别采用茜素红染色-光镜、四环素荧光标记-激光扫描共聚焦显微镜、扫描电镜观察矿化结节的形态结构,并利用扫描电镜结合能谱仪原位定量分析钙元素;此外,在培养中加入可抑制成骨细胞增殖、分化的肿瘤坏死因子α作为对照实验。结果与结论:3种观察方法均可观察到正常成骨细胞矿化结节的形态结构。对于肿瘤坏死因子α抑制成骨细胞产生矿化结节的情况,经茜素红染色-光镜观察法,未见明显的矿化结节;而四环素荧光染色-激光扫描共聚焦显微镜观察法,可见清晰、稀少的矿化结节;扫描电镜观察法明显可见较少而细小的矿化结节,提示后二种方法灵敏度较高。此外,扫描电镜可将观察成骨细胞分泌钙质、形成矿化结节的亚细胞结构,与能谱元素分析结合,可实现矿化结节的定位与定量,在骨病研究中值得推广应用。

解毒消癥饮诱导胃癌细胞凋亡相关基因表达的研究

目的:探讨中药复方解毒消癥饮对人胃癌细胞凋亡相关基因表达的影响。方法:将人胃癌细胞株BGC-823分成空白对照组及药物干预低、中、高剂量组,分别加入空白对照血清和相应剂量的解毒消癥饮大鼠含药血清,培养24h、48h和72h;免疫荧光染色法检测细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Fas及Fas-L的表达,应用激光共聚焦显微镜观察并做半定量分析;另行电镜制样、观察。结果:胃癌细胞经解毒消癥饮含药血清干预后,Bax、Fas表达明显增加(P<0.05),且随药物浓度增加该趋势更加明显,Fas-L则随药物浓度的增加表达明显减弱(P<0.05);Bcl-2表达量无明显变化。电镜见胃癌细胞出现早期凋亡现象,主要为细胞核异染色质边聚;线粒体嵴消失、基质深染。结论:解毒消癥饮可能通过调控胃癌细胞Bax、Fas及Fas-L等基因,从而促进细胞凋亡,并降低细胞免疫逃逸的功能。

健骨颗粒对骨质疏松模型大鼠垂体-肾上腺轴的影响

目的 :从垂体 -肾上腺轴角度探讨健骨颗粒治疗Ⅰ型原发性骨质疏松症的作用机制。方法 :通过切除SD大鼠双侧卵巢建立Ⅰ型原发性骨质疏松模型 ,随机分成 3组 ,分别喂服健骨颗粒、骨松宝和生理盐水。用药 12周后处死取材 ,检测血清皮质醇 (COR)浓度 ,取脑垂体行ACTH细胞免疫化学染色 (S -P法 )并形态计量 ,肾上腺行HE染色。结果 :切除卵巢 12周后大鼠出现骨质疏松 ,血清COR浓度以及垂体ACTH阳性细胞数和染色面积均明显高于假手术组 (行腹部切口 ,但不切除卵巢 )。用药 12周后健骨颗粒组血清COR水平、垂体ACTH阳性细胞数和染色面积均较生理盐水组降低或减少。结论 :补肾健脾中药健骨颗粒可有效调节去卵巢骨质疏松模型大鼠垂体 -肾上腺轴的病理变化和功能状态 ,抑制雌激素水平降低后的异常骨吸收。

健骨颗粒对去卵巢骨质疏松模鼠骨组织结构的影响

目的 :观察健骨颗粒对去卵巢骨质疏松模鼠股骨颈超微结构的影响以及同期骨密度 (BMD)的改变 ,探讨该药药效及作用机制。材料和方法 :SD雌性大鼠去卵巢造模 ,随机分成健骨颗粒预防组和治疗组 ,并设生理盐水和骨松宝对照组。术后 2 4周处死 ,分别行骨密度检测及股骨颈骨粒透射电镜观察。结果 :去势 1 2周 ,骨细胞以吸收相和退变相为主 ,BMD明显降低。生理盐水组骨细胞多表现为退变相 ,骨细胞性溶骨更加明显 ,且出现破骨细胞性溶骨现象。健骨颗粒治疗组和骨松宝组多见成骨相骨细胞 ,成骨细胞活性加强 ,BMD明显升高。健骨颗粒预防组活跃的成骨细胞数量明显增加 ,可见成骨细胞成骨过程 ,BMD接近假手术组。结论 :健骨颗粒能有效防治骨质疏松的发生和发展。本文还就其作用机制进行了讨论。

健骨颗粒对骨质疏松模鼠垂体-甲状腺轴的影响

目的 为进一步探讨健骨颗粒治疗原发性骨质疏松症的作用机理 ,拟从垂体 甲状腺轴角度进行研究。方法 建立 6月龄SD雌性大鼠卵巢摘除骨质疏松模型 ,模型成立后随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组 ,分别喂服生理盐水、骨松宝和健骨颗粒。喂药 12周后处死取材 ,取血清检测TSH、FT3 、FT4、CT等浓度 ,取垂体、甲状腺作TSH细胞、C细胞及Tg等免疫细胞化学染色 ,并形态计量。结果 喂服中药组的血清TSH、FT3 、FT4、CT浓度均明显上升 ,与生理盐水组相比有显著统计学意义。Ⅱ、Ⅲ两组TSH细胞和C细胞的细胞数均高于Ⅰ组。Ⅲ组Tg阳性反应物也明显较Ⅰ组多 ,颜色深。 结论 健骨颗粒能有效扭转卵巢摘除后垂体 甲状腺轴功能减退的趋势 ,改善甲状腺的整体功能 ,从而增加骨形成抑制骨吸收 。

去卵巢大鼠肿瘤坏死因子-α、降钙素、骨钙素与骨质疏松的关系

目的通过观察卵巢切除后机体血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、雌二醇(E2)、骨钙素(BGP)、降钙素(CT)的含量变化及其与骨密度之间的关系,探讨绝经后骨质疏松症的发病机理。方法以去卵巢大鼠为模型,定期检测模鼠骨密度和血清TNF-α、E2、BGP、CT的含量变化,并分析它们之间的相关性。结果术后12周模型组血清中的TNF-α、BGP浓度明显升高,而血清E2、CT浓度却下降,与假手术组相比均有统计学意义(P<0.05)。术后12周,模型组骨密度显著低于假手术组(P<0.005),而且随着术后时间的延长持续下降。相关分析显示:血清TNF-α、BGP与腰椎BMD负相关,而E2、CT与腰椎BMD正相关。结论当卵巢摘除E2水平下降时,骨代谢异常的病理机制是广泛而复杂的。其中TNF-α含量的增加,是骨吸收增强,发生骨质疏松不容忽视的原因之一。

去卵巢骨质疏松大鼠成骨细胞G_1期调节蛋白的改变

背景:G1期调节蛋白对调控增殖细胞的增殖周期具有重要作用,目前关于成骨细胞G1期调节蛋白的研究甚少,绝经后骨质疏松与成骨细胞G1期调节蛋白的关系更未被阐明。目的:观察去卵巢大鼠骨质疏松发病过程中成骨细胞G1期调节蛋白的改变,探讨绝经后骨质疏松症的发病机制。方法:100只6月龄SD雌性大鼠,随机分成假手术组和模型组各50只,模型组进行双侧卵巢结扎切除术,假手术组除未行卵巢结扎切除外,其余步骤与手术组相同。所有大鼠于术后4,8,12,18,24周分批取材,每批每组各处死10只,取大鼠腰椎。运用免疫组织化学方法检测骨组织中成骨细胞G1期调节蛋白CyclinD1、CDK4、p21蛋白表达。结果与结论:CyclinD1、CDK4蛋白阳性表达主要定位于骨小梁表面的成骨细胞。假手术组有CyclinD1、CDK4蛋白阳性表达,模型组表达强于假手术组。p21蛋白阳性表达部位与CyclinD1相似,假手术组和模型组均有明显阳性表达,但模型组的表达维持在较高水平,在各时期均明显高于同期假手术组(P<0.01)。结果证实,去卵巢骨质疏松模型大鼠发病过程中,成骨细胞CyclinD1、CDK4、p21蛋白出现明显高表达。提示成骨细胞增殖加快,同时成骨细胞周期受阻滞亦增多,成骨细胞数量相对不足,骨形成低于骨吸收,导致骨质疏松的发生。

透骨消痛胶囊促进成骨细胞的增殖和分化

背景:透骨消痛胶囊是福建中医药大学治疗骨关节炎的临床验方,以往的研究多集中于其对软骨的作用。目的:观察透骨消痛胶囊对成骨细胞增殖、分化及骨重塑相关因子表达的影响。方法:以透骨消痛胶囊干预大鼠成骨细胞 ROS17/2.8,分空白对照组和各浓度透骨消痛胶囊组,MTT 法测定细胞增殖,比色法检测成骨细胞分化的生物标志物碱性磷酸酶活性,ELISA 法检测骨钙素,茜素红染色观察骨矿化结节,实时定量 PCR 和 ELISA 法检测骨重塑相关因子骨保护素/核因子κB受体活化因子配体的表达。结果与结论:与对照组相比,质量浓度为 0.25-2 g/L 透骨消痛胶囊能显著促进 ROS17/2.8 细胞增殖(P < 0.05),上调碱性磷酸酶活性(P < 0.05)、骨钙素的表达水平(P < 0.05)和矿化结节面积(P < 0.05),增加骨保护素/核因子κB受体活化因子配体的比例(P < 0.05)。提示透骨消痛胶囊防治骨关节炎的作用机制可能与其促进成骨细胞的增殖、分化以及调节骨重塑平衡的作用有关。

应用microCT技术对中药干预去卵巢小鼠骨组织微结构的分析

目的应用micro CT技术观察健骨颗粒对C57小鼠去卵巢骨质疏松模型骨组织骨量、骨微结构及生物力学的影响。方法将4周龄清洁级C57小鼠30只随机分为三组(假手术组10只、卵巢切除小鼠两组各10只),两组卵巢切除小鼠术后1周开始,分别用健骨颗粒和生理盐水进行灌胃,假手术组用生理盐水灌胃。2个月后,小鼠左胫骨行micro CT检测及图像分析、右胫骨行生物力学三点抗压最大载荷检测。结果与假手术组比较,去卵巢组BMC、BMD、Mean、BV、BS显著下降(P<0.01),TMC下降(0.01<P<0.05);与去卵巢组比较,去卵巢中药组BMC、BMD、Mean指标显著提高(P<0.01);图像分析结果显示去卵巢组较假手术组骨皮质薄,骨小梁数量少,形态细小、不连续呈扭曲或断裂状等明显骨质疏松病理特征,去卵巢中药组介于两者之间。生物力学结果显示三组胫骨三点抗压最大载荷均具有明显差异(P<0.01)。结论去卵巢2月成功建立小鼠绝经后骨质疏松症模型;健骨颗粒抗骨质疏松作用明显,主要通过增加骨量和改善骨小梁微结构来最终提高骨强度;micro CT对骨质疏松参数分析简洁、高效,图像多维、全面,与传统的检测方法相比,具有一定的优势。

卵巢切除大鼠在不同时期RANKL、OPG蛋白表达的变化及与BTMs的相关性

目的探讨卵巢切除大鼠在不同时期骨保护素(OPG)、核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的表达及与骨转换标志物(BTMs)的关系。方法将SD雌性大鼠随机分成假手术组(Sham)和去卵巢骨质疏松模型组(OVX),模型组行双侧卵巢切除术,术后第2、6、10、14周分批取材,采用Western blot检测各时期大鼠骨组织OPG、RANKL蛋白表达,采用Elisa检测各时期大鼠血清骨转换标志物BGP、BALP、CTX-I、TRAP-5b的变化。结果 OVX组在术后第2周(P<0.01)和第10、14周(P<0.05)骨组织RANKL蛋白表达均较Sham组显著升高,OPG蛋白表达在第2周(P<0.01)和第6周(P<0.05)均显著降低。(2)与Sham组相比,OVX组术后第2周血清BGP、BALP、CTX-I(P<0.05)和TRAP-5b(P<0.01)水平均显著升高;OVX组术后第6周血清BGP、BALP水平显著升高(P<0.01),CTX-I(P<0.05)和TRAP-5b(P<0.01)水平显著下降;OVX组术后第10、14周血清CTX-I(P<0.05)、BALP(P<0.01)水平显著升高。(3)骨转换标志物血清CTX-I、TRAP-5b水平与骨OPG表达成负相关(P<0.01),与骨RANKL表达成正相关(P<0.05)。结论相关性分析显示骨转换标志物CTX-I、TRAP-5b与骨OPG成负相关,与骨RANKL成正相关。

鹿衔草挥发油的化学成分及其对成骨细胞增殖的影响

目的分析鹿衔草挥发油的化学成分,研究其对体外培养成骨细胞增殖的影响。方法采用水蒸气蒸馏法提取鹿衔草挥发油,GC-MS检测化学成分;鹿衔草挥发油干预成骨细胞系ROS17/2.8后,采用MTT法检测成骨细胞增殖,流式细胞术检测成骨细胞增殖周期,实时荧光定量PCR检测成骨细胞PCNA mRNA表达。结果一定浓度的鹿衔草挥发油能促进成体外培养成骨细胞增殖,处于增殖周期的成骨细胞比例明显增加,且成骨细胞的增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)mRNA表达显著提高。结论鹿衔草挥发油通过上调PCNA表达,加速成骨细胞增殖周期进程,从而促进成骨细胞增殖。

多种特殊染色法在骨关节炎组织形态学研究中的应用比较

目的探讨多种特殊染色法在骨关节组织中的染色规律及其在骨关节炎形态学研究中的应用价值。方法 6月龄健康新西兰大白兔20只,随机分为正常组和造模组各10只,根据改良Hulth法造模,6周后膝关节取材。对标本固定、脱钙后进行石蜡包埋和切片。分别采用HE、番红-固绿、AB-PAS、甲苯胺蓝、Van Gieson染色和Mallory染色,观察骨关节组织的形态学变化,并对几种染色方法进行比较。结果 HE染色显示关节一般组织形态结构,可见模型组关节软骨和软骨下骨发生骨性关节炎病理变化;番红-固绿染色法中软骨和软骨下骨的界限(黏合线)以及潮线显示清晰,软骨基质中糖胺聚糖含量减少,纤维成分增多;AB-PAS染色显示骨关节炎软骨基质糖胺聚糖尤其是酸性糖胺聚糖含量减少;甲苯胺蓝染色显示骨关节炎软骨的酸性糖胺聚糖减少;Van Gieson染色和Mallory染色可显示骨关节组织中的胶原纤维,但组织结构界限不够清晰。结论在骨性关节炎的组织形态学研究中,通过常规HE染色,结合番红-固绿染色法和AB-PAS染色法,能较客观全面地获得关节组织形态学相关信息。

健骨颗粒对去势大鼠骨密度及骨钙素的影响

探讨健骨颗粒对去势骨质疏松模鼠骨密度 ( BMD)以及血清骨钙素 ( BGP)的影响。方法 :建立大鼠去卵巢骨质疏松模型 ,随机分成四组 :A生理盐水组、B骨松宝用药组、C健骨颗粒中剂量用药组、D健骨颗粒大剂量用药组。按设计分批取材 ,检测 BGP浓度和 BMD。结果 :用药 6周时 ,与 A组对比 ,各组 BGP无明显变化 ,仅 D组的腰椎密度提高 ( P<0 .0 5 ) ;用药 1 2周时 ,B、C、D组的 BMD明显上升 ,BGP显著下降 ,有统计学意义。结论 :健骨颗粒能够扭转去卵巢大鼠的高骨钙素变化 ,降低高骨转换率 。