遗传性牙本质疾病致病基因突变谱的生物信息学研究

运用PolyPhen-2,SignalP 3.0,SplicePort等多种生物信息学软件对遗传性牙本质疾病致病基因(牙本质涎磷蛋白基因)突变谱进行总结和生物信息学分析。在已知60个患者家系中的40个突变中,发现19个错义突变或无义突变发生在DSP结构域,而21个移码突变发生在DPP结构域。在DSP结构域中,1个突变可能改变信号肽剪切位置;4个突变降低信号肽剪切的可能性;10个突变干扰外显子间的剪接;1个突变提前终止翻译过程;还有3个突变可能对多肽的空间结构产生影响。由于在DPP结构域的移码突变缺乏合适的分析软件,尚无法准确评估各个突变发生后的生物学效应。

硒元素及硒蛋白在糖尿病肾病中的表达变化

目的检测糖尿病肾病(DN)患者血浆及全血中硒元素含量,以及高糖条件下人肾小球系膜细胞中硒蛋白的表达变化,探究硒与DN的关系。方法收集正常对照及DN患者全血及血浆,用原子吸收光谱法检测血浆和全血中的硒元素含量;用30mmol/L的高糖刺激人肾小球系膜细胞,实时定量PCR检测人类硒蛋白表达谱的变化;非配对t检验和Pearson相关分析检验组间差异及指标间的相关关系。结果 DN患者血浆(P<0.000 1)及全血(P<0.001)中的硒含量与对照组相比均显著降低。患者血浆硒含量与血尿素氮及血肌酐水平呈负相关(r=-0.368、-0.413),与糖化血红蛋白水平也呈负相关(r=-0.400)。人肾小球系膜细胞在高糖刺激24h后硒蛋白Gpx1、TrxR2、TrxR3、Dio2、Dio3、SelK、SelN、SelP、SelR、SelT、SelW、SPS2的表达显著降低,初步筛选出了有表达差异的硒蛋白。结论DN患者体内存在明显低硒状态,高糖环境下人肾小球系膜细胞一些硒蛋白的表达显著降低,为阐明低硒敏感的硒蛋白在DN发生发展中的作用提供了临床和实验依据。

硒对人肾小球系膜细胞硒蛋白表达的影响

目的体外模拟低硒(Se)条件,检测Se对人肾小球系膜细胞硒蛋白的表达影响。方法低硒条件(0.5%胎牛血清)处理人肾小球系膜细胞系(HMCs)5 d,紧接着以不同浓度(0、10 nM、25 nM、50 nM、100 nM、250 nM)亚硒酸钠刺激细胞不同时间(0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h),建立HMCs低硒及补硒细胞模型。低硒培养HMCs 0~9 d,使用细胞谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒检测细胞谷胱甘肽过氧化物酶活性。RT-PCR法检测标准培养条件下HMCs25种硒蛋白表达谱。实时定量PCR法及western-blotting法检测补硒实验中硒蛋白表达变化。结果人体25种硒蛋白中的21种可被检测到,仅有4种硒蛋白(GpX2,GpX3,GpX6和DIO1)的表达未达到可被检测到的水平。低硒培养条件下,9种硒蛋白的表达显著下调,包括:GpX1、TrxR2、DIO2、DIO3、SelH、SelN、SelR、SelT、SelW。其中,GpX1、SelN、SelW的表达对浓度梯度和时间梯度的补硒敏感。结论 HMCs的硒蛋白GpX1、SelN、SelW的表达受浓度梯度和时间梯度补硒的影响。进一步的研究需要集中在Se对硒蛋白表达的调控和其在CKD进展中的作用上。

硒蛋白S截短和全长重组质粒的构建与表达

目的构建截短和全长硒蛋白S(SelS)重组体,以期在细胞系中或动物体内高表达并观察其生物学效应。方法用基因重组技术构建SelS的截短体和全长的重组质粒,截短体基因只包含mRNA的编码序列(CDS),全长包括mRNA的CDS和3′非翻译区(UTR)序列,此序列中含硒代半胱氨酸的插入序列(SECIS)。将重组质粒送公司测序并比对。用脂质体2000将硒蛋白SelS质粒转染至细胞中,24h后观察绿色荧光蛋白的表达,流式细胞技术检测细胞的转染效率;收集细胞用Trizol法提取总RNA,将mRNA反转录为cDNA,以此为模板用PCR扩增以观察目的基因的表达。结果测序结果显示重组序列与目的基因完全一致,质粒构建成功。显微镜下可观察到细胞高表达绿色荧光蛋白,经流式细胞技术验证细胞的转染效率达到40%以上。PCR产物的凝胶电泳结果显示:与对照组及其他实验组相比,只有转染了目的基因的实验组高表达截短和全长的SelS基因。结论成功构建SelS截短的和全长的重组质粒并转染入细胞中高表达,对观察硒蛋白截短体和完整形式在细胞系或动物体内的生物学效应提供了基础。

慢性肾脏病患者血清硒元素水平及其与临床指标的相关性

目的探究血浆硒含量在我国慢性肾脏病(CKD)患者各个阶段的严重程度及与临床指标相关性。方法检测107名研究对象(包括23名健康对照、10名CKD3期、11名CKD4期、45名CKD5期、6名腹膜透析及12名血液透析患者)的基本临床指标和硒、铁、铜、钙、钾、磷6项元素的血浆含量。结果随着患者肾功能不全的进展,患者血浆中的硒元素不断下降,尤其在终末期接受血液净化治疗的患者中,以腹膜透析患者血浆中硒含量最低;CKD患者血浆硒含量与血白蛋白、血总胆固醇、血三酰甘油呈正相关,与甲状旁腺素、血尿素氮及血肌酐水平呈负相关;CKD不同分期患者的血浆硒含量与钙元素呈正相关。结论 CKD患者普遍存在低血硒,且与病情严重程度及临床指标相关,应深入研究,以期为低硒地区人群精确补硒及CKD发病率的防治提供坚实的理论依据。