基于极化荧光方法的人LOX-1配体高通量筛选

目的建立以极化荧光为检测方法的高通量筛选技术,通过大规模筛选发现氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX1)的天然配体。方法密度梯度超速离心获得正常人血中低密度脂蛋白(LDL),然后用CuSO4(5μmol·L-1)修饰为氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)。FITC标记hLOX1,以受体(LOX1)和配体(oxLDL)的相互作用为基础建立筛选模型,用极化荧光检测方法,在激发光485nm、发射光525nm,对3200个样品进行高通量筛选,并用Z′因子值评价实验。结果Z′因子值为0.75,根据建立的基于极化荧光的高通量筛选实验方法,发现3个化合物与hLOX1有较高的结合活性,IC50值小于31.6μmol·L-1。结论极化荧光检测方法适合于高通量筛选技术,具有较高的稳定性、灵敏性和可重复性。

重组人凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1在毕赤酵母中表达条件的优化

采用单因子和正交试验对毕赤酵母重组菌株产生人凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(rhLOX-1)的发酵过程进行了优化,确定了最佳发酵条件:0.8%甲醇,1.8%酪蛋白水解物,初始pH 7.0,3×接种量。在此培养条件下,rhLOX-1在毕赤酵母重组菌株中的表达量可超过100 mg/L,比对照提高了1倍以上。本研究为大规模发酵制备rhLOX-1蛋白奠定了基础,更好地满足了LOX-1的理论研究及新药筛选的需要。

不完全酶切去除载体多个相同酶切位点的简易方法

以去除真核表达载体pIGF3的3个EcoR 位点为例,介绍一种通过不完全酶切去除载体多个相同酶切位点的方法。本方法步骤简单,经济实用。

凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1的cDNA克隆及在毕赤酵母中的表达(英文)

凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)是氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的主要受体,它与动脉粥样硬化过程密切相关。通过RT-PCR从THP-1细胞系获得LOX-1 cDNA并被克隆到载体pPIC9K的a信号肽的下游。线性化的重组质粒转化Pichia pastoris GS115。阳性转化子经过BMMC液体培养基培养,上清液经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,出现1条在受体菌对照中不曾有的大小约43 kDa的蛋白带。重组蛋白的功能研究在进行中。