Klenow(exo-)蛋白的制备及其在RAA检测体系中的应用研究

为了建立一种Klenow(exo-)蛋白的制备方法,并对其在RAA(recombinase-aid amplification)技术中的应用进行初步研究,通过Overlap点突变法构建获得目的基因片段,并构建Klenow(exo-)蛋白表达载体进而转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行诱导表达。表达产物通过Ni-NTA螯合层析进行初步纯化,然后用Heparine柱层析进一步纯化,通过SDS-PAGE鉴定纯化产物,获得了纯度较高的目的蛋白。用纯化后的目的蛋白配制RAA反应体系,针对肉源实际样本设计突变位点进行检测。实验结果显示该体系具有较强的特异性,在模板基因序列3′端出现双碱基差异时不会进行有效扩增,相较于常规的PCR检测方式该体系能够实现双碱基差异位点的有效区分。该技术未来有望大规模应用于SNPs的检测。

用重组酶介导扩增技术快速扩增核酸

体外核酸快速扩增技术是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的技术,自问世以来,被广泛应用于分子生物学、医学和法理鉴定等领域,并被不断改进,以使其功能和适应性更为广泛.重组酶介导扩增法是在现有体外核酸扩增原理的基础上发展起来的恒温体外快速扩增核酸技术.RAA法利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶代替了传统PCR的热循环解链过程,实现了在37℃恒温下的核酸快速扩增,无需特殊的辅助仪器,对操作人员的要求也不高,具备简单、节能、便携、快速等特点,有望在不远的将来取代传统的热循环PCR反应.

体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新

利用聚合酶链式反应(PCR)进行的核酸体外扩增是1983年开始发展起来的一项革命性技术,目前已被广泛运用于现代化的农业和医学以及食品工业等领域,特别是在人类认知基因和基因组的过程中,体外核酸扩增技术做出了卓越的贡献。最初,体外核酸扩增技术主要是利用耐高温的DNA聚合酶(Taq酶),这样就使核酸的体外扩增反应可以在热循环中进行。但因需要使用昂贵的设备和消耗大量的电力,其成本和应用范围都受到一定的限制。之后,恒温体外核酸扩增悄然兴起,这改变了传统扩增技术的局限性,使核酸的体外扩增更加简单和方便。重组酶介导扩增(RAA)法是一种最新型的恒温体外核酸扩增技术,该系统的显著优点在于它在常温下就能实现DNA解链并快速扩增(15～30min完成),反应快速、专一性好、灵敏度高,还可用于定时定量的结果分析。