鲍曼不动杆菌外膜蛋白A通过Akt/mTOR/p70S6K信号通路引起RAW264.7细胞自噬

目的:分析鲍曼不动杆菌标准株ATCC 19606(Acinetobacter baumannii ATCC 19606)外膜蛋白A(outer membrane protein A,Omp A)对RAW264. 7细胞的自噬诱导作用。方法:建立Omp A刺激RAW264. 7细胞的模型,通过细胞免疫荧光染色、Western blot和透射电子显微镜检测Omp A对RAW264. 7细胞自噬的影响。结果:Omp A可以引起自噬蛋白LC3B-II表达升高,并抑制Akt/mTOR/p70S6K的磷酸化水平;雷帕霉素可以进一步降低mTOR和p70S6K磷酸化,并提高Omp A引起的LC3B-II表达升高。结论:鲍曼不动杆菌Omp A通过Akt/mTOR/p70S6K信号通路引起RAW264. 7细胞自噬。这为将来进一步研究鲍曼不动杆菌引起自噬的分子机制及找到对抗其感染的新方法提供理论依据。

鲍曼不动杆菌外膜蛋白A真核表达载体构建及其诱导Hela细胞不完全自噬

目的构建鲍曼不动杆菌ATCC19606(Acinetobacter baumannii ATCC 19606)外膜蛋白A(outer membrane protein A,OmpA)的真核表达载体pEGFP-OmpA,研究OmpA对Hela细胞自噬的影响。方法采用PCR方法扩增鲍曼不动杆菌ATCC19606的OmpA基因,将其克隆至真核表达载体pEGFP-N1,以构建重组质粒pEGFP-OmpA;用脂质体转染法将其转染Hela细胞;流式细胞术、细胞免疫荧光和Western blot检测OmpA表达水平;激光共聚焦显微镜检测OmpA在Hela细胞中的定位;Western blot及透射电子显微镜检测OmpA对Hela细胞自噬的影响。结果经双酶切及测序鉴定表明pEGFP-OmpA质粒构建成功;OmpA可以大量表达于Hela细胞的细胞质和细胞核中;OmpA可导致Hela细胞中自噬相关蛋白LC3BⅡ、p62和Beclin-1表达升高,而且在Hela细胞中发现自噬小体;OmpA会干扰p62降解,引发不完全自噬。结论本研究成功构建pEGFP-OmpA真核表达载体,它可以在Hela细胞中高效表达,并可导致Hela细胞不完全自噬,这为将来进一步研究鲍曼不动杆菌OmpA引起自噬的机制奠定基础。

肺纤维化风险预测的临床生物化学模型

目的应用数据挖掘技术分析肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)患者及对照组血清生物化学数据,为疾病的早期诊断提供有益线索。方法本研究收集PF患者(n=29)和健康对照(n=55)的生物化学检测数据,采用Z-计分和Log2转换方式将数据进行归一化处理,用主成分分析与贝叶斯回归分析方法提取特征指标,构建PF患者血清生物化学指标的风险预测模型,并进行受试者操作特征分析。结果与正常对照相比,PF患者血清中的α-羟丁酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、白蛋白、白蛋白与球蛋白比值、前白蛋白及钙浓度差异有统计学意义(P<0.05)。其中α-羟丁酸脱氢酶是一种有效预测潜在PF风险的生物化学检测指标。结论本研究对PF血清生物化学数据进行挖掘分析,成功构建了PF血清生物化学预测模型。

In Situ PLA技术原位分析MTA1与NuRD复合体其他组分的相互作用

目的原位检测肿瘤转移相关蛋白MTA1与NuRD复合体其他组分-Mi2、HDAC2及MBD3的相互作用并分析MTA1/NuRD复合体在HCT116细胞中的分布情况。方法首先利用co-IP技术体外验证MTA1与NuRD复合体其他组分Mi2、HDAC2及MBD3在HCT116细胞裂解液中的相互作用。然后利用In Situ PLA技术,体内原位检测MTA1与三者的相互作用,并根据镜下阳性荧光信号数目,比较MTA1与Mi2、HDAC2及MBD3之间的作用强弱;根据相互作用位点的亚细胞分布情况,分析间期及M期MTA1/NuRD复合体的核质分布情况。结果首次从体内原位水平证实MTA1与NuRD复合体其他组分-Mi2、HDAC2及MBD3的相互作用;其作用强度HDAC2最高,Mi2次之,MBD3最弱;首次发现MTA1/NuRD复合体存在很明显的胞质分布(约占总量的1/4);另外,我们还首次发现在M期MTA1/NuRD复合体不再位于核区,而是位于染色体外周。结论In Situ PLA技术是一项有效的原位检测蛋白相互作用的新技术;MTA1/NuRD复合体可能参与MTA1胞质中功能的发挥;并且其胞质分布可能参与M期进程调控。

胰岛素样生长因子Ⅰ/细胞外信号调节激酶通路在肺纤维化中的作用及可能机制

目的 探讨胰岛素样生长因子Ⅰ （IGF-Ⅰ）/细胞外信号调节激酶（ERK）通路在肺纤维化中的作用及可能机制.方法 以肺泡上皮细胞A549为研究对象.酶联免疫吸附（ELISA）法检测0、50、100 ng/ml IGF-Ⅰ对细胞培养上清液中基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9浓度的影响;用ERK特异抑制剂对IGF-Ⅰ诱导细胞MMP-2和MMP-9的表达进行阻断实验,分3组：空白对照组（未加IGF-Ⅰ刺激组）、IGF-Ⅰ刺激组、ERK抑制剂＋IGF-Ⅰ刺激组.Western印迹法检测各组细胞中ERK的磷酸化（p-ERK）情况.分别用实时荧光定量PCR法和ELISA法检测各组细胞MMP-2和MMP-9的mRNA水平和上清液中的蛋白浓度.结果 相对于0 ng/ml IGF-Ⅰ组,50、100 ng/ml IGF-Ⅰ可上调肺泡上皮细胞培养上清液中MMP-2和MMP-9的浓度[（18.30±0.11、21.80±0.09）比（13.52 ±0.19）ng/ml和（0.34±0.叭、0.39±0.01）比（0.25±0.01） ng/ml,均P＜0.001],且100 ng/ml IGF-Ⅰ组中二者浓度均高于50 ng/ml IGF-Ⅰ组（均P＜0.01）;IGF-Ⅰ刺激组中p-ERK1/2蛋白的相对表达量高于空白对照组（0.40±0.01比0.23±0.02,P＜0.05）,ERK抑制剂＋IGF-l刺激组中p-ERK1/2蛋白相对表达量低于IGF-Ⅰ刺激组（0.14±0.03比0.40±0.01,P＜0.01）;相对于IGF-Ⅰ刺激组,ERK抑制剂＋ IGF-Ⅰ刺激组抑制了MMP-2和MMP-9的mRNA水平（0.88±0.03比1.17±0.05和0.82±0.23比1.81 ±0.27,P＜0.05）和降低了细胞培养上清液中MMP-2和MMP-9的蛋白浓度[（21.70±0.32）比（29.15±0.34）ng/ml和（0.22±0.01）比（0.29±0.01） ng/ml,均P＜0.01].结论 IGF-Ⅰ可能是通过活化ERK信号通路上调肺泡上皮细胞MMP-2和MMP-9的表达,从而导致肺泡基底膜被破坏,最终促进了肺纤维化的发生.

富勒烯C60对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响

目的观察富勒烯C60对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响。方法健康C57BL/6J小鼠20只，按随机数字表法随机分为正常对照组、博来霉素组、高剂量C60组、低剂量C60组各5只。博来霉素组、低剂量C60组及高剂量C60组通过气管内注射博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型，正常对照组则以生理盐水代替博来霉素。低剂量C60组、高剂量C60组于注射博来霉素前1天开始，每天通过腹腔注射分别给予小鼠1 mg/kg、10 mg/kg水溶性富勒烯C60，正常对照组及博来霉素组则给予等体积生理盐水。观察14 d小鼠的生存率、体质量变化；通过HE及Masson染色，根据Ashoft评分评价肺纤维化程度；通过碱水解法测定肺组织羟脯氨酸含量；采用酶联免疫吸附（ELISA）法测定肺组织、血浆以及支气管肺泡灌洗液（BALF）中转化生长因子β1（TGF－β1）、肿瘤坏死因子α（TNF－α）的水平；运用DCFH－DA探针检测活性氧的含量[以荧光强度/微克蛋白（OD/μg）表示]。结果富勒烯C60干预后小鼠体质量下降减缓；低剂量C60组、高剂量C60组病理形态学上纤维化Ashoft评分均显著低于博来霉素组[（4.08±0.52）、（3.00±0.41）比（6.75±0.75）分，均P〈0.01]；低剂量C60组、高剂量C60组肺组织羟脯氨酸含量均显著低于博来霉素组[（0.36±0.06）、（0.35±0.08）比（0.55±0.16）μg/mg，均P〈0.05]；高剂量C60组支气管肺泡灌洗液（BALF）、肺组织中TGF－β1含量均低于博来霉素组，但差异均无统计学意义[（9.38±5.32）比（23.60±8.96）pg/ml、（2.89±0.35）比（6.44±2.95）pg/mg，均P〉0.05]，高剂量C60组血浆、BALF及肺组织中TNF－α含量均显著低于博来霉素组[（4.56±0.73）比（7.21±2.26）pg/ml、（34.58±23.30）比（151.00±27.34）pg/ml、（22.99±5.83）比（122.90±22.04）pg/mg，均P〈0.05]；并且，高剂量C60组肺组织中活性氧含量显著低于博来霉素组[（19.68±0.91）比（22.92±1.71）OD/μg，P〈0.05]。结论富勒烯C60可减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化程度。

二甲双胍对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的作用

目的探讨二甲双胍对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的作用。方法将30只小鼠按随机数字表法分为正常对照组、博来霉素组、二甲双胍组3组各10只。博来霉素组和二甲双胍组以1.75 μl/g气管内注射浓度为2 mg/ml的博来霉素以制造肺纤维化模型，正常对照组气管内注射等量生理盐水。于造模前一天，二甲双胍组给予二甲双胍溶液（200 mg/kg）灌胃，1次/d，连续14 d。观察各组用药期间小鼠生存状态，于造模后第14天取材并对肺组织进行HE染色、Masson染色及纤维连接蛋白免疫组化染色，根据Ashcroft评分评价肺纤维化程度；通过碱水解法测定肺组织中羟脯氨酸的含量；采用酶联免疫吸附（ELISA）法测定血浆、支气管肺泡灌洗液（BALF）以及肺组织中转化生长因子β1（TGF－β1）的水平。结果正常对照组、博来霉素组、二甲双胍组小鼠第14天存活率分别为10/10、4/10、7/10；二甲双胍组肺组织Ashcroft评分显著低于博来霉素组[（3.82±0.58）比（7.79±0.06）分，P〈0.05]；二甲双胍组肺组织羟脯氨酸含量显著低于博来霉素组[（0.40±0.05）比（0.73±0.10）μg/mg，P〈0.05]；二甲双胍组血浆、BALF、肺组织中TGF－β1含量均显著低于博来霉素组[（2.32±0.68）比（4.59±0.45）ng/ml、（0.81±0.09）比（1.40±0.06）ng/ml、（17.12±0.83）比（21.25±0.69）ng/mg，均P〈0.05]。结论二甲双胍可减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化程度。