荧光定量PCR检测c-Met CAR病毒感染T细胞的效率

目的:通过设计特异性引物,应用荧光定量PCR方法检测c-Met CAR病毒感染T细胞的效率。方法:应用基因重组技术构建c-Met CAR(GFP)逆转录病毒质粒。应用病毒包装技术制备c-Met CAR病毒与c-Met CAR(GFP)病毒,感染T细胞制备c-Met CAR-T细胞与c-Met CAR-T(GFP)细胞。Western blot检测c-Met CAR和c-Met CAR(GFP)在293T细胞中表达的外源性CD3ζ蛋白。设计特异性引物应用荧光定量PCR检测CAR病毒对T细胞的感染效率,并与流式细胞术的检测结果进行比较。结果:构建c-Met CAR(GFP)质粒,荧光显微镜可观察到c-Met CAR(GFP)质粒在293T细胞上表达绿色荧光蛋白。c-Met CAR和c-Met CAR(GFP)病毒感染的293T细胞可表达外源性CD3ζ蛋白。荧光定量PCR检测c-Met CAR与c-Met CAR(GFP)的感染效率分别为(52.1±1.7)%、(55.9±2.3)%。流式细胞术检测c-Met CAR(GFP)病毒感染效率为(50.7±3.6)%,两种检测方法比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:通过设计特异性引物,应用荧光定量PCR方法能够特异性检测CAR病毒对T细胞的感染效率,该检测方法结果准确、安全,对CAR-T细胞的临床应用具有实用价值。

Trop2对胃癌细胞耐药性的影响及机制研究

目的:探讨滋养层细胞表面抗原2(Trop2)对胃癌细胞化疗耐药的影响及机制。方法:应用慢病毒转染技术将Trop2 sh RNA转染至BGC823细胞株,通过嘌呤霉素筛选出稳定转染质粒的细胞株;q RT-PCR、Western blot和免疫荧光方法检测质粒干扰效率;CCK-8细胞增殖试验和流式细胞术检测柔红霉素对BGC823细胞株增殖能力和细胞凋亡的影响;q RT-PCR、Western blot检测耐药相关基因TopoⅡα的m RNA和蛋白表达变化。结果:在稳定转染Trop2 sh RNA质粒的sh Trop2组中,Trop2 m RNA及蛋白表达水平较对照组(未处理)和sh NC组(转染空载体质粒)明显下调;在相同药物浓度下,柔红霉素对shTrop2组的增殖抑制率明显高于对照组和sh NC组,sh Trop2组半数抑制浓度低于对照组和sh NC组(P<0.05),sh Trop2组中柔红霉素诱导的细胞凋亡率显著高于对照组和sh NC组(P<0.05);稳定干扰Trop2表达后耐药相关基因TopoⅡα的表达显著上调。结论:Trop2通过抑制TopoⅡα的表达,可增强胃癌细胞对柔红霉素的耐药性。

靶向Trop-2 CAR-T细胞的制备及其体外对卵巢癌细胞杀伤作用的研究

目的:制备靶向人滋养层细胞表面抗原2(human trophoblast cell surface antigen 2,Trop-2)的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T),观察Trop-2 CAR-T细胞在体外对卵巢癌细胞增殖的影响。方法:运用分子克隆及基因重组技术构建Trop-2 CAR;采用Western blot检测Trop-2 CAR在293T细胞中的表达;CCK-8法检测Trop-2 CAR-T细胞对卵巢癌细胞增殖的影响;ELISA检测细胞因子分泌的变化。结果:酶切鉴定及测序分析结果表明,Trop-2 CAR各基因片段连接正确;Western blot检测结果显示,该质粒能够在293T细胞中有效表达;CCK-8结果显示,制备的Trop-2 CAR-T细胞在体外能明显抑制表达Trop-2的卵巢癌细胞的增殖(P<0.05);ELISA检测结果表明Trop-2 CAR-T细胞与表达Trop-2的卵巢癌细胞共培养后,干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白介素(interleukin-2,IL-2)细胞因子分泌增加(P<0.01)。结论:该研究成功制备了Trop-2 CAR-T细胞,可有效抑制Trop-2表达阳性的卵巢癌细胞的增殖。

不同雄激素受体表达的三阴性乳腺癌患者的超声表现及其临床意义

目的 探讨三阴性乳腺癌(TNBC)患者的超声表现与雄激素受体(AR)表达的关系,为TNBC的患者的临床诊疗提供更准确的影像学参考。方法 回顾性分析127例病理组织学确诊为TNBC患者的超声声像图,根据患者病理结果分为AR阳性组与AR阴性组,并进行组间对比分析其生物学表达情况。结果 127例TNBC患者AR阳性组与阴性组比较,肿瘤的形态特征、直径大小及肿块纵横比之间无明显相关性(P>0.05),但是在肿块后方回声、边缘边界、微钙化、晕环、淋巴结肿大以及血管弹性成像等方面,31例AR阴性组中患者27例发生肿块后方回声衰减,远远多于阳性组(4/13)、7例阴性组中患者5例观察到边缘毛刺,3个阴性组患者全部可以观察到晕环(P<0.05)。超声表现中探及微钙化及丰富的血流信号时,也常提示AR的表达呈阴性(P<0.05);发生淋巴结肿大、淋巴结转移时,AR常为阴性表达(P<0.05)。结论 TNBC患者中AR的表达与超声声像图的表现具有一定的相关性,AR表达阴性的患者肿瘤侵袭性强、恶性程度高,且发生远处转移及复发的风险增大。

抗MetFab-DOX对人肝癌细胞的多柔比星耐药作用

目的抗MetFab-DOX能抑制肝细胞肝癌HepG2的增殖,而关于抗MetFab-DOX对多柔比星(DOX)耐药肝癌细胞的作用研究较少。文章构建DOX耐药细胞HepG2/DOX并探讨抗MetFab-DOX对该细胞耐药性的影响。方法使用大剂量间歇诱导法构建DOX耐药肝癌细胞模型HepG2/DOX;细胞分为对照组(不加药物)、DOX组(5μg/m L)、抗MetFab-DOX组(含有DOX浓度5μg/m L),采用CCK8法、流式细胞凋亡检测、细胞免疫荧光、划痕愈合实验以及Transwell侵袭实验检测抗MetFab-DOX对HepG2/DOX增殖、凋亡、药物内化以及生物学功能的影响;构建HepG2/DOX荷瘤裸鼠模型并检测抗MetFabDOX处理后对肿瘤体积和形态的影响。结果耐药细胞株HepG2/DOX细胞对DOX以及抗MetFab-DOX的敏感性均明显降低,HepG2细胞与HepG2/DOX细胞的IC50差异均有统计学意义(P<0.05)。不同药物处理24h后,抗MetFab-DOX组细胞凋亡率高于DOX组(19.87%vs 8.09%,P<0.05);当药物作用48 h时,抗MetFab-DOX组细胞凋亡率亦高于DOX组(41.27%vs16.15%,P<0.01)。抗MetFab-DOX组以及DOX组在30 min细胞内化情况没有明显的差异,而在60 min以及120 min时抗MetFab-DOX组DOX荧光强度高于DOX组。抗MetFab-DOX组24 h细胞划痕愈合率(14.46%)低于DOX组(16.80%)和空白对照组(19.88%),差异有统计学意义(P<0.05)。不同药物处理48 h后,与空白对照组细胞划痕愈合率(56.43%)和DOX组(36.96%)相比,抗MetFab-DOX处理后显著下降(22.60%),差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组单个视野平均穿膜细胞数(1043.52个)比较,DOX组(880.51个)和抗MetFab-DOX组(646.18个)明显减少(P<0.05),且抗MetFab-DOX组明显低于DOX组(P<0.05)。药物处理第40天时,抗MetFab-DOX组抑瘤率明显高于DOX组(64.00%vs 35.27%,P<0.05)。对照组中移植瘤组织细胞排列不规则,增殖期肿瘤大小不一,数目占比大。DOX组与对照组相比,细胞增生略有下降。在抗MetFabDOX组中,肿瘤细胞进一步出现明显的皱缩变小,肿瘤细胞数量减少。结论抗MetFab-DOX能有效降低肝细胞肝癌对DOX的耐药性,其机制可能与抗MetFab-DOX能够增加药物细胞中的积聚,诱导细胞凋亡相关。

潜伏膜蛋白2A嵌合抗原受体-T细胞的制备及对鼻咽癌细胞杀伤作用的研究

目的制备靶向潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein2A,LMP2A)的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)-T细胞,观察LMP2ACAR-T细胞体内外对鼻咽癌细胞的杀伤作用。方法2016年9月至2017年12月,本研究以基因工程技术构建抗LMP2A慢病毒表达载体,测序鉴定并通过Western blot法验证抗LMP2ACAR在293T细胞中的表达;通过质粒包装体系制备LMP2ACAR慢病毒,并感染人T细胞,制备LMP2ACAR-T细胞;CCK-8法检测LMP2ACAR-T细胞对鼻咽癌细胞的杀伤作用。酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测LMP2A抗原激活后的LMP2ACAR-T细胞白细胞介素(IL)-2与干扰素(IFN)-γ的分泌水平。体内实验观察LMP2ACAR-T细胞对鼻咽癌移植瘤的抑瘤作用。SPSS21.0统计学软件用于统计分析。结果PCR结果显示抗LMP2ACAR片段大小约为1500bp,与理论值相一致,测序显示序列正确;Westernblot结果显示抗LMP2A慢病毒表达载体能在293T细胞中表达;CCK-8法结果发现在效靶比为20∶1、10∶1与5∶1时,LMP2ACAR-T细胞对LV-LMP2A-CNE1细胞的杀伤率分别为(72.11±9.75)%、(54.65±5.42)%与(36.68±3.80)%,与CD19CAR-T细胞、T细胞相比差异有统计学意义(P<0.05),而对CNE1细胞的杀伤作用与CD19CAR-T细胞和T细胞相比差异无统计学意义;ELISA法结果发现LMP2ACAR-T细胞与LV-LMP2A-CNE1细胞共培养上清中IL-2与IFN-γ的含量,显著高于与CNE1细胞共培养上清,差异具有统计学意义(P<0.05);体内实验中LMP2ACAR-T细胞组瘤体体积为(80.3±10.0)mm3,显著小于各对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功制备的LMP2ACAR-T细胞对LMP2A阳性的鼻咽癌细胞具有显著靶向杀伤效应。

靶向c-Met嵌合抗原受体T细胞的制备及其对鼻咽癌细胞作用的研究

目的构建靶向c-Met的嵌合抗原受体(CAR)逆转录病毒载体,制备靶向c-Met CAR-T,观察其对c-Met阳性鼻咽癌细胞的杀伤作用。方法利用基因工程技术构建抗c-Met scFv,并将其重组到含有CD28,CD137,CD3ζ等的逆转录病毒载体中,形成c-Met CAR逆转录病毒载体,测序确认。以该病毒载体感染T淋巴细胞,通过Western blotting检测c-Met CAR在T淋巴细胞中的表达。CCK-8检测c-Met CAR-T对鼻咽癌细胞的作用;通过ELISA检测c-Met CAR-T作用后IFN-γ、IL-2的变化。结果测序结果显示c-Met CAR病毒载体序列正确;Western blotting可检测到CD3ζ的表达;CCK-8结果显示,c-Met CAR-T明显抑制c-Met阳性的鼻咽癌细胞的增殖(P<0.05);ELISA结果显示,c-Met CAR-T作用后分泌IFN-γ、IL-2明显增加(P<0.01)。结论成功制备了靶向c-Met的嵌合抗原受体逆转录病毒载体。该嵌合抗原受体能在T细胞中表达,能有效抑制c-Met阳性鼻咽癌细胞增殖,增加IFN-γ、IL-2的分泌。