熟地黄上调木糖基转移酶Ⅰ信号途径促进阴虚大鼠脑内γ-氨基丁酸合成的机制研究

目的基于木糖基转移酶Ⅰ(xylt-1)信号途径探讨熟地黄及其活性成分地黄苷D、梓醇对脑内γ-氨基丁酸(GABA)的调控机制。方法(1)将SD大鼠随机分为正常组、模型组、治疗组(熟地黄组,30 g·kg^(-1)),每组8只,雌雄各半。采用辛温燥湿利湿中药复方(30 g·kg^(-1))灌胃诱导建立阴虚大鼠模型,早晚各1次,连续10 d。造模结束后,治疗组灌胃熟地黄水煎液,早晚各1次,连续10 d。测定记录大鼠体质量并通过旷场行为学实验检测其活跃度、穿格次数及总路程;采用ELISA法检测大鼠血清促性腺激素释放激素(GnRH)、促甲状腺素释放激素(TRH)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)水平;qPCR法及全自动毛细管蛋白印迹法检测大鼠脑组织中xylt-1、多配体蛋白聚糖1(SDC-1)、早期生长反应因子1(EGR1)、谷氨酸脱羧酶1(GAD67)mRNA及蛋白表达水平;HPLC法检测脑组织中GABA含量。(2)采用siRNA沉默大鼠高分化肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)的xylt-1基因,细胞分为正常组、阴性对照组、沉默组、沉默+地黄苷D(10μmol·L-1)组、沉默+梓醇(10μmol·L-1)组。采用qPCR法检测细胞中xylt-1、SDC-1、EGR1、GAD67 mRNA表达水平;HPLC法检测细胞内、外液GABA含量;免疫荧光法检测细胞中SDC-1表达水平。(3)采用慢病毒转染PC12细胞过表达xylt-1基因,细胞分为正常组、阴性对照组(空载组)、过表达组。然后采用qPCR法检测细胞中xylt-1、SDC-1、EGR1、GAD67 mRNA表达水平;HPLC法检测细胞内、外液GABA含量。结果(1)与正常组比较,模型组大鼠的体质量显著降低(P<0.01),活跃度显著升高(P<0.01),穿格次数及总路程显著增加(P<0.01);血清LH、FSH、GnRH、CRH、TRH水平均显著升高(P<0.01);海马及大脑皮层组织中的GABA含量明显降低(P<0.05,P<0.01);脑组织中的xylt-1、SDC-1、EGR1、GAD67 mRNA(海马、大脑皮层组织)及蛋白(下丘脑、大脑皮层组织)表达均显著下调(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,治疗组大鼠经熟地黄干预后的体质量明显升高(P<0.05),活跃度显著下降(P<0.01),总路程明显缩短(P<0.05);血清LH、FSH、GnRH、CRH、TRH水平均显著下降(P<0.01);海马及大脑皮层组织中的GABA含量明显升高(P<0.05,P<0.01);脑组织中的xylt-1、SDC-1、EGR1、GAD67 mRNA(海马、大脑皮层组织)及蛋白(下丘脑、大脑皮层组织)表达均显著上调(P<0.05,P<0.01)。(2)与阴性对照组比较,沉默组细胞的xylt-1、SDC-1、EGR1、GAD67 mRNA表达显著下调(P<0.01);细胞内、外液中的GABA含量明显降低(P<0.05,P<0.01);细胞中SDC-1表达显著下调(P<0.01)。与沉默组比较,沉默+地黄苷D组细胞的xylt-1mRNA表达上调,但差异无统计学意义(P>0.05),沉默+梓醇组细胞的xylt-1 mRNA表达明显上调(P<0.05);沉默+地黄苷D组、沉默+梓醇组细胞的SDC-1、EGR1、GAD67 mRNA表达显著上调(P<0.05,P<0.01),细胞内、外液中的GABA含量显著升高(P<0.01),细胞中SDC-1表达显著上调(P<0.05,P<0.01)。(3)与正常组及阴性对照组比较,过表达组细胞的xylt-1 mRNA表达显著上调(P<0.01)。与阴性对照组比较,过表达组细胞的SDC-1、EGR1、GAD67 mRNA表达显著上调(P<0.01),细胞内、外液中的GABA含量显著升高(P<0.01)。结论脑内可能存在调节GABA合成的xylt-1/SDC-1/EGR1/GAD67通路,熟地黄可能通过上调该通路提高脑内GABA水平。