海南省类鼻疽伯克霍尔德菌临床分离株的基因岛特征和毒力因子分析

目的分析类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)临床分离株的基因岛(genomic island,GI)特征和毒力因子差异,为类鼻疽病的诊疗研究提供依据。方法收集B.pseudomallei临床分离株,PCR检测和测序分析毒力相关GI,在Islandviewr 4平台上提交全基因组序列注释格式文件,整合SIGI-HMM与IslandPath-DIMOB两种算法预测GI,通过序列比对分析GI独特性和毒力因子差异。结果共收集到52株B.pseudomallei临床分离株,结果显示,52个基因组按进化距离分为3个分枝,其中82.69%(43/52)菌株集中在分枝1。52个B.pseudomallei基因组共识别出828个GI,按序列相似性聚类为157个GI cluster。GI在基因组中占比达2.05%~6.38%。GI cluster1和2存在全部菌株中,但84个(53.50%)GI cluster只聚类到单个基因组。10个GI cluster很可能是特有的,其中5个来源同属细菌,2个来源其他属,3个来源不确定。25个GI cluster与毒力相关,B.pseudomallei BP76和BP169含有其中8个,是所有菌株中毒力相关GI最多的。52株B.pseudomallei的毒力基因除了fhaB1、fhaB2、BPSL1661、cheY1、wzM、tssH-5/clpV、tssA-5、boaA和boaB存在差异,其余都表现一致。与泰国和澳大利亚B.pseudomallei临床菌株比较,boaA、boaB、cheY1和chbp在两个国家的菌株中都表现出差异,同时fhaB1、fhaB3和bimA在澳大利亚菌株中表现出差异。结论海南地区B.pseudomallei GI具有保守性和独特性,通过特有GI和毒力因子研究,可以发现菌株水平基因转移(Horizontal gene transfer,HGT)的来源和分子水平的毒力差异。

三亚地区综合性医院213株产ESBLs肺炎克雷伯菌的临床分布及耐药性基因的检测

目的了解三亚市人民医院肺炎克雷伯菌的标本来源及耐药基因情况,为临床合理用药和控制院内感染提供依据。方法从2013年1月至2014年12月各临床送检标本中分离肺炎克雷伯菌,采用Phoenix-100全自动细菌鉴定药敏系统进行药敏试验,按照标准纸片扩散法进行超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)表型的筛选和确证,依据当年的美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准判读结果,用WHONET 5.6软件对所有数据进行统计分析。用聚合酶链反应(PCR)对213株产ESBLs的肺炎克雷伯菌进行常见的几种的耐药基因进行检测。结果分离并确认213株产ESBLs肺炎克雷伯菌,标本来源主要是痰、呼吸道分泌物,占78.4%;其次是分泌物标本和中段尿,分别占8.92%和5.2%。对头孢噻肟耐药率最高(98.1%);对亚胺培南的耐药率最低(2.86%)。213株产ESBLs肺炎克雷伯菌中有195株能检测到1个或多个耐药基因,分别为CMY,CTX,TEM,SHV,DHA1和KPC,其检出率分别为6.10%、76.53%、59.62%、76.06%、12.21%和2.82%。结论该院肺炎克雷伯菌主要分离自痰、呼吸道分泌物,对常用抗菌药物均产生了一定的耐药性,应进一步了解该院产ESBLs菌株的耐药基因的分布,预防医院感染的发生和多重耐药菌的产生。

类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染THP-1细胞模型的评价及其感染机制的初步探讨

目的建立类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei,B.pseudomallei,BP for short)感染人急性单核白血病细胞THP-1的细胞模型,探讨聚乙二醇3350(PEG 3350)对细菌侵入细胞及胞内生存的影响,对比类鼻疽伯克霍尔德氏菌与其减毒株(也称为泰国株,即Burkholderia thailandensis,B.thailandensis,BT for short)的感染特性。方法通过绘制细菌生长曲线,探讨类鼻疽伯克霍尔德氏菌及其减毒株的增殖规律;通过透射电镜观察细菌胞内感染状态和宿主细胞的超微病理变化;分析不同时相的细菌入胞率和胞内生存状态,探讨细菌与宿主细胞的相互作用;通过检测受感染细胞培养液的上清和患者血清中的细胞因子,评价宿主细胞的反应性和PEG对于细菌侵入细胞及胞内生存的影响,以及对比细胞受类鼻疽伯克霍尔德氏菌及其减毒株感染后的炎症反应性,从而评价该模型的稳定性。结果确定了B.pseudomallei和B.thailandensis的生长规律和感染时相特征及超微病理损伤特点。炎症因子测定中,两种细菌感染细胞后分泌的TNF-α出现感染中期的高峰,受BP感染的细胞的IL-6分泌则呈双峰改变,受BT感染的细胞IL-6的分泌和PEG对细胞分泌炎症因子的影响更为复杂。同时,患者血清中细胞因子的检测则没有显示出一定的规律,与其临床转归关系也不明确。结论成功构建类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染THP-1细胞的模型,初步探讨了类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染宿主细胞的机制。

三亚市汉族和黎族女性MTHFR与MTRR基因多态性分布特征

目的分析三亚市汉族和黎族女性5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)与甲硫氨酸合成酶还原酶(methionine synthase reductase,MTRR)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)分布特征,为个体化指导女性增补叶酸及预防出生缺陷提供依据。方法以三亚市420例黎族女性及1 590例汉族女性为研究对象,采集其口腔黏膜上皮细胞,提取基因组DNA,采用荧光定量PCR方法对MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因位点多态性进行检测分析,并与其他已报道的民族进行比较。结果三亚市黎族女性MTHFR C677T位点基因多态性分布与思南苗族、延边朝鲜族、南宁壮族、乌苏哈萨克族、银川回族、新疆维吾尔族、张家界土家族相比均有显著性差异(P <0.05)。MTHFR A1298C位点基因多态性分布与三亚汉族、思南苗族、延边朝鲜族、银川回族、张家界土家族相比均有显著性差异(P <0.05)。MTRR A66G位点基因多态性分布与三亚汉族、思南苗族、延边朝鲜族、南宁壮族、银川回族、张家界土家族相比均有显著性差异(P <0.05)。结论三亚市黎族女性MTHFR和MTRR基因多态性分布不同于其他民族,具有民族特异性。

类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统BPSS1617蛋白的重组表达及其抗体制备

目的构建重组表达类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统蛋白BPSS1617,并制备其抗体。方法采用PCR扩增BPSS1617全长序列,克隆至原核表达载体p ET-22b,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,免疫新西兰兔,制备其多克隆抗体,并通过Western blot、免疫荧光和ELISA检测抗体的特异性,并分析该蛋白在类鼻疽杆菌中的亚细胞定位。结果成功扩增类鼻疽杆菌BPC006株基因组中的BPSS1617基因;酶切和测序验证重组表达质粒p ET-22b-BPSS1617构建成功;经IPTG诱导表达、包涵体洗涤、纯化以及变性复性,成功获得纯度>95%,分子量为25×103的目的蛋白;将纯化的BPSS1617重组蛋白免疫新西兰兔,获得抗BPSS1617蛋白多克隆抗体,经实验验证其特异性良好;同时BPSS1617蛋白主要定位于类鼻疽杆菌的细胞质中。结论成功构建、表达、纯化获得BPSS1617蛋白,并成功制备了其特异性多克隆抗体,并且该蛋白定位于类鼻疽杆菌的细胞质中。

对氧磷酶2基因311Cys/Ser多态性及血脂血糖指标与海南地区阿尔茨海默病的相关性研究

目的探讨对氧磷酶2(PON2)基因311Cys/Ser(C/S)基因多态性及血脂血糖指标与海南地区阿尔茨海默病(AD)的关系。方法用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术对22例AD患者和31例年龄匹配的健康对照者进行PON2-311Cys/Ser基因多态性及血脂血糖指标的分析。结果 AD患者组PON2-311基因频率和等位基因频率与健康对照组之间比较无显著性差异。总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、载脂蛋白A(ApoA)、载脂蛋白B(ApoB)和血糖(Glu)在老年性痴呆症患者和健康对照者间无显著性差异(P>0.05)。SS基因型人群中低密度脂蛋白(LDL-C)在老年性痴呆症患者和健康对照者间有显著性差异(P<0.05)。结论海南地区PON2基因C311S多态性及血脂血糖指标与AD患者没有显著相关性。

新型冠状病毒实时荧光RT-PCR检测的性能验证

目的对实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸进行方法学评价.方法依据ISO15189和CNAS-GL039性能评价文件及厂家声明,对本法精密度、准确度、检测下限、特异性和抗干扰能力进行验证.结果RT-PCR试剂检测SARS-CoV-2核酸结果的精密度均小于允许变异度,准确性和重复性的符合率均为100%,检测下限为1.0×103 copies/mL,内源性抗干扰能力CV<5%,与感染部位相同或感染症状相似的其他病原体等无交叉反应.结论RT-PCR检测方法灵敏度高,重复性好,抗干扰力强,检测下限和特异性均符合要求,可用于临床检测.

妊娠滋养细胞疾病患者血清CD44v6、MMP-2、TIMP-2水平变化及临床意义

目的探讨妊娠滋养细胞疾病血清变异型细胞间黏附分子(CD44v6)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、金属蛋白酶组织抑制因子-2(TIMP-2)水平变化及对葡萄胎恶变的预测价值。方法选取妊娠滋养细胞疾病患者60例(葡萄胎47例,侵蚀性葡萄胎9例,绒毛膜癌4例)和同期体检健康妇女30例对照组,检测其血清CD44v6、MMP-2、TIMP-2水平变化,分析血清CD44v6水平与MMP-2、TIMP-2水平的相关性。结果妊娠滋养细胞疾病患者血清CD44v6、MMP-2、TIMP-2均高于对照组(P均<0.05),且葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌血清CD44v6、MMP-2、TIMP-2呈逐渐升高状态,不同类型患者比较均具有统计学差异(P均<0.05)。2年随访47例葡萄胎10例发生恶变,37例未发生恶变;恶变患者血清CD44v6、MMP-2、TIMP-2均高于未恶变患者(P均<0.05)。Logistic回归分析显示,血清CD44v6、MMP-2、TIMP-2水平升高均是葡萄胎恶变的危险因素(P均<0.05);Pearson直线相关性分析显示,血清CD44v6和MMP-2、TIMP-2之间均呈正相关(r分别为0.721、0.882,P均<0.05)。结论妊娠滋养细胞疾病患者血清CD44v6和MMP-2、TIMP-2水平均出现不同程度的升高,三者协同作用,共同促进妊娠滋养细胞疾病的发生及进展。

可可毛色二孢致角膜溃疡病例分析

本文报告1例可可毛色二孢致角膜溃疡。患者男,54岁,右眼发红,疼痛加重3天。眼科检查见右眼球结膜混合充血,角膜全层灰白色浑浊,呈地图状,面不平,前房下方可见淡白色沉积,余眼内情况窥不清。取角膜刮取物标本进行真菌荧光染色镜检和培养,对培养的菌株进行形态学和分子生物学鉴定,用E-test法进行丝状真菌药敏试验。真菌荧光染色后,镜下可见有隔菌丝。培养14 d有分生孢子座产生,分生孢子位于分生孢子座里。对培养出的丝状真菌进行基因测序,测序后确定病原菌为可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae,L.theobromae),临床诊断为可可毛色二孢引起的角膜溃疡。药敏试验结果显示,L.theobromae对两性霉素B和伏立康唑相对敏感。给予局部药物治疗,氟康唑滴眼液q2h滴右眼,同时使用氟康唑氯化钠注射液0.4 g qd静脉滴注。患者治疗5 d未见好转,要求出院。

三亚地区血流感染病原菌分布及常见菌株耐药性分析

目的：了解三亚地区血流感染病原菌的流行分布和耐药情况，为临床医生合理使用抗菌药物提供科学依据。方法采用上海奥普双相血培养瓶（2011年1~5月）和美国BD BACTEC FX全自动血培养仪（2011年6月至2013年8月）进行血培养，用美国BD Phoenix l00自动细菌鉴定仪和珠海迪尔的DL-96细菌鉴定系统进行生化鉴定和药物敏感性分析。结果血培养阳性率为8.68%，其中革兰氏阴性杆菌占55.32%，革兰氏阳性球菌占40.62%，真菌占2.9%。革兰氏阴性菌排名前三位的是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、假鼻疽伯克霍尔德菌；革兰氏阳性菌则以金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和其他凝固酶阴性葡萄球菌为主。哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星对血流感染的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌敏感率均〉90.0%。未发现碳青霉烯类耐药的革兰氏阴性杆菌。MRCNS的检出率明显高于MRSA，尚未发现万古霉素和利奈唑胺耐药的葡萄球菌。结论我院血流感染的病原菌种类较多，临床医生应掌握本地区细菌分布情况和耐药特征，根据药敏结果和患者情况采取有效的治疗方案，这对提高治愈率和控制耐药菌株的泛滥具有十分重要的意义。

布氏弓形菌致肝硬化患者菌血症例

布氏弓形菌(Aliarcobacter butzleri)已被确定为一种新的肠道人畜共患病原体[1],有记录的人类感染病例报告越来越多。该菌通常引起肠道腹泻疾病和腹膜炎,也可引起菌血症[2]。本文报道从1例肝硬化失代偿两年余的患者血培养标本中分离出布氏弓形菌,体外药敏鉴定结果显示仅对亚胺培南、美罗培南、甲氨苄唑-磺胺甲噁唑敏感,对头孢菌素类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类药物均耐药,但治疗布氏弓形菌的最佳抗生素选择还待研究[3]。

2019年三亚市某医院细菌耐药性监测结果分析

目的了解海南省三亚市某医院临床分离菌对临床常用抗菌药的敏感性和耐药性。方法收集2019年1月1日-2019年12月31日海南省三亚市某医院临床分离株,细菌鉴定和药敏试验采用细菌鉴定药敏分析仪进行测定,并用纸片扩散法补充进行。根据美国临床和实验室标准化协会标准判断结果,用WHONET 5.6软件进行数据分析。结果2019年共收集临床分离株共3853株,其中革兰阳性菌858株,占22.27%,革兰阴性菌2603株,占67.56%。金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌中甲氧西林耐药株的平均检出率分别为11.29%和43.31%。甲氧西林耐药株对多数测试药的耐药率均高于甲氧西林敏感株,未发现耐万古霉素的菌株。粪肠球菌对多数测试抗菌药的耐药率均低于屎肠球菌,未发现万古霉素的耐药株。肺炎链球菌非脑膜炎株对青霉素的耐药率为6.25%。鲍氏不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为29.21%和34.92%。铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为1.57%和1.83%。结论临床应加强细菌耐药监测,遏制耐药细菌的进一步流行播散。

海南省类鼻疽临床流行病学研究及其应用

类鼻疽是由类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)引起的一种重要的热带人兽共患病.流行区域主要分布在南、北纬20°间,以澳大利亚北部,泰国东北部以及我国海南、香港、台湾、广东等地区常见.该菌可通过呼吸道、消化道、经破损皮肤传播,临床表现多样化,有"似百样病"之称,易误诊.主要侵犯人体肺部,造成肺炎、肺脓肿以及肺部空洞,还可引起皮肤、肝脏、脾脏等多器官脓肿,严重者可发展为败血症.目前无有效的疫苗预防,死亡率高,已被美国疾病预防控制中心列为生物恐怖制剂和I级病原微生物.海南省是我国类鼻疽主要疫源地,Burkholderia pseudomallei分离率和临床患者数为全国之最.随着海南国际旅游岛的经济战略位置提升和南海安全军事战略要求,海南与国内外的交流和合作愈发频繁,人员流动性大,若缺乏有效的预防,诊断和治疗措施,极易引起Burkholderia pseudomallei的广泛传播,造成巨大的经济损失和社会影响.因此,加强类鼻疽相关研究具有重大的社会经济效益和应用价值.

常规消毒剂对类鼻疽伯克霍尔德菌的杀灭效果分析

目的分析评价临床及科研中常用4种消毒剂对类鼻疽伯克霍尔德菌的杀灭效果,为临床类鼻疽治疗和科研活动中对该病原体的生物防护和沾染消除提供参考。方法选取临床及科研中常用4种消毒剂:碘伏,新洁尔灭,75%乙醇,"84"消毒液,在不同温度、不同消毒液浓度条件下,观察其在单位时间内对不同浓度的类鼻疽菌菌液中活菌的杀灭效果。结果常温条件下,0.5%碘伏和0.3%氯己定处理10min能杀灭类鼻疽菌,0.5%"84"消毒液20min、2%"84"消毒液5min也能有效杀灭该病原体,PerasafeTM消毒液和75%乙醇的杀灭处理3min即能起到洗消的目的。结论临床常用消毒剂对致病性的类鼻疽菌的杀灭效果较好,以PerasafeTM消毒液和75%乙醇的灭菌效果最佳,该试验提示,在未到达足够安全级别的实验室中进行少量病原操作(如分子生物学相关实验)和非严格隔离的病房内进行类鼻疽的临床诊疗过程中,有效防范类鼻疽菌的播散和传染并不困难,但基于类鼻疽菌的严重危害性和感染的高风险性,常规消毒剂的有效性还需要在更全面的动物模型上进行评价。

基于illumina测序技术分析小泡巨鼠肠道微生物多样性

为探讨海南岛的小泡巨鼠肠道微生物群落组成及其菌群多样性。2019年12月于海南医学院-香港大学热带传染病联合实验室提取25只海南岛的成年小泡巨鼠(14只雄和11只雌性)粪便样本DNA,基于IonS5TMXL测序平台,利用单端测序(Single-End)的方法,构建小片段文库进行单端测序。通过对测序片段剪切过滤,操作分类单元(Operational Taxonomic Units,OTUs)聚类,利用mothur方法与SSUrRNA数据库对OTUs进行物种注释及丰度分析,并进一步开展α多样性分析(Alpha Diversity)和β多样性分析(Beta Diversity)。结果显示,从25只小泡巨鼠肠道粪便样本中共得到高质量序列1481842条,归属为14个门、85个科、186个属。从门分类水平上,小泡巨鼠的主要核心生物群有厚壁菌门(Firmicutes,46.04%),拟杆菌门(Bacteroidetes,25.34%);随后依次为变形菌门(Proteobacteria,17.09%),柔壁菌门(Tenericutes,7.38%),放线菌门(Actinobacteria,1.67%);这5个门占所有菌门的97.52%。属水平上螺杆菌属(Helicobacter)所占比例最大,为12.44%;其次为乳杆菌属(Lactobacillus,11.39%),梭菌属(Clostridium,6.19%),支原体属(Mycoplasma,4.23%),黄杆菌属(Flavonifractor,3.52%)。综上,高通量测序分析表明海南岛小泡巨鼠肠道菌群结构复杂,菌种多样,具有进一步研究的意义。

全自动血培养系统与双相血培养系统应用对比

目的比较及评价全自动血培养系统BDBACTEC FX与双相血培养系统的临床应用,以提高检测率。方法回顾性分析奥普双相血培养系统检测1140份血标本和全自动血培养系统BDBACTEC FX检测1338份血标本,对检出阳性的病原菌种类、时间和阳性率、污染率进行比较分析。结果双相血培养检测标本1140份,检出病原菌70份,阳性率为6.1%;BDBACTEC FX检测标本1338份,检出病原菌128份,阳性率为9.6%;双相血培养系统最快阳性检出时间为20h,BDBACTEC FX最快阳性检出时间为3h30min,24、48、72h内检出的阳性数分别占78.0%、90.8%、98.9%。结论应用BDBACTEC FX全自动血培养系统最大优点缩短了阳性检出时间,为抢救患者赢得了时间,其次检出细菌种类增多,提高了血培养的阳性率,但成本大;奥普双相血的特点为也能较快、较准地检出病原菌,具有成本较低、使用方便的特点,适于县级医院使用。

BACTEC FX全自动血培养仪阳性结果分析及应用评价

目的对美国BD公司BACTEC FX全自动血培养仪进行血培养结果分析,并对其临床应用进行评价。方法收集2011年10月-2012年11月医院收治怀疑血流感染患者的血液标本,血培养及鉴定采用美国BD公司BACTEC FX全自动血培养仪和BD Phoenix l00自动细菌鉴定仪。结果 2 590份血液标本中实际检出阳性标本264份,阳性率10.2%,假阳性率0.15%;264株病原菌中,最快检出时间为2.7h,有26.9%在12h内检出,51.1%在24h内检出,86.0%在48h内检出,95.8%在72h内检出;有40.5%标本厌氧瓶先报警、需氧瓶后报警,34.5%标本需氧瓶先报警、厌氧瓶后报警,11.8%标本需氧瓶先报警、但厌氧瓶不报警。结论美国BD公司BACTEC FX全自动血培养仪操作简便、灵敏度高,提高了细菌检出的阳性率及种类,检出速度更快捷、更准确,为治疗患者赢得了宝贵的时间。

不同靶基因检测新型冠状病毒结果分析

目的比较三种不同靶基因检测2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的检测结果,分析其一致性,初步评估各试剂的应用情况。方法收集43份本院患者和定点治疗医院送来的咽拭子标本,根据临床诊断分为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)组31份和对照组12份,用三种SARS-CoV-2核酸检测试剂同时进行实时荧光逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测,检测结果的阳性率差异和一致性分别用Fisher精确概率检验和Kendall′s协调系数W检验。结果在COVID-19组中试剂B的阳性检出率最高为90.32%,且不存在需复检结果;试剂A和试剂C的阳性检出率分别为77.42%和74.19%,且试剂C出现的需复检结果较多;在对照组中试剂A和试剂C未检测出阳性,但试剂B出现一例阳性结果。COVID-19组中各试剂的阳性检出率差异不具有统计学意义(P>0.05);一致性方面差异具有统计学意义,渐进显著性Sig=0.00,Kendall′sW系数值为0.852,说明三种试剂检测结果的一致性程度很高。结论三种试剂对COVID-19核酸检测的结果一致性很好,灵敏度方面试剂B较有优势,特异性方面试剂A和试剂C较稳定。试剂B最适合疫情期间的严格排查,但应注意假阳性结果的出现;试剂A和试剂C针对假阴性和需复检结果需要提高检测样本的质量,且试剂C的结果判读方式在处理大批量阳性标本数据时体验欠佳。