CpOGA^(D298N)与核心链霉亲和素Stv13融合表达用于检测蛋白质O⁃GlcNAc修饰

氧连接的β-N-乙酰葡萄糖胺修饰(O-GlcNAc修饰)是一种发生在蛋白质丝氨酸、苏氨酸羟基上的一种动态、可逆的翻译后修饰。O-GlcNAc修饰在细胞的许多关键过程中发挥重要作用,也是研究阿尔茨海默病和糖尿病等的重要途径,但是常用于O-GlcNAc蛋白检测的抗体特异性或者检测分子量范围仍存在问题且耗时(~36 h)过长,对后续研究造成困扰。在本研究中,我们设计构建了产气荚膜梭菌OGA(O-GlcNAcase)突变体(CpOGA^(D298N))与核心链霉亲和素Stv13融合表达质粒pET28a-CpOGA^(D298N)-Stv13。将质粒pET28a-CpOGA^(D298N)-Stv13转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,获得了融合蛋白质CpOGA^(D298N)-Stv13。通过CpOGA^(D298N)特异性结合O-GlcNAc的能力及生物素-亲和素特异性亲和作用,设计了Far-Western blot(Far-WB)用于检测蛋白质O-GlcNAc修饰,利用sOGT(short form O-GlcNAc transferase)、去O-GlcNAc修饰sOGT、细胞裂解液样本及人肝细胞核因子1A(hepatocyte fuclear factor 1A,HNF1A)对该方法进行验证。本研究成功构建了一种蛋白质O-GlcNAc修饰检测方法,耗时相对O-GlcNAc特异性抗体缩短至5~7 h,丰富了蛋白质O-GlcNAc修饰的检测方法,为其后续研究奠定了基础。