鸭疫里默氏杆菌三磷酸甘油醛脱氢酶的鉴定及其分子特征分析

为探讨鸭疫里默氏杆菌(R.anatipestifer)致病的分子机制,检测了血清Ⅰ、Ⅱ型分离菌株CZ2、AF菌体细胞表面蛋白及分泌蛋白的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活性,对gap基因进行PCR检测、克隆测序和生物信息学分析,并以抗重组GAPDH小鼠Ig G为一抗对GAPDH的分布进行免疫印迹分析。结果显示,R.anatipestifer CZ2、AF株菌体细胞表面及细胞上清液蛋白能将3-磷酸甘油醛转化为1,3-二磷酸甘油酸,具有GAPDH活性;编码基因开放阅读框大小为1 002 bp,编码334个氨基酸,理论相对分子质量36 700;R.anatipestifer的GAPDH含有NAD+结合区和活性催化区2个结构域,不含信号肽序列或疏水区,与肠溶血性大肠杆菌等病原微生物的GAPDH处于同一分支,属Ⅰ类GAPDH。结果证明,R.anatipestifer CZ2、AF株具有胞外分泌的GAPDH,可能在其致病过程中发挥重要作用。

鸭疫里默杆菌表型相关基因在重庆、四川分离株中的分布及遗传多样性分析

为研究鸭疫里默杆菌(R.anatipestifer)表型相关基因在四川、重庆地区分离株中的分布及遗传多样性,探讨其致病力发生差异的分子基础及可能机制,以分离自鸭、鹅的22株鸭疫里默杆菌为对象,采用PCR方法检测细胞壁相关水解酶(CWAH)、转录调节子(TR)、类脂A生物合成酰基转移酶(Lipid A)、插入元素蛋白IS1转座(IS1)、双组份转录调控因子(TCTR)、转录调控因子(LuxR1、LuxR2)、酰基-CoA还原酶(LuxC)、嗜好模块毒素(AMT)、协同溶血素(CAMP)、血凝素(Hema)、三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、外膜蛋白A(OmpA)、热休克蛋白类似物(GroEL)、Ton依赖识别受体(TbdR1、TbdR2)、滑动性运动蛋白J(GldJ)、铁限制性依赖受体(DtxR)共计18个蛋白编码基因在分离菌株中的分布,并对阳性扩增基因进行测序和遗传多样性分析。使用CLC Genomics Workbench 6.5进行二代数据的基因组测序和拼接,将获得的血清Ⅰ型菌株RS、RC和血清Ⅱ型菌株RA的全基因组序列与GenBank登录序列进行比对分析。PCR检测结果显示,22个菌株均检测到OmpA、Lipid A、Hema、CAMP、TbdR1、TbdR2、DtxR的编码基因,鹅源分离株中未能检测到CWAH、AMT基因,而非致病性菌株DX1、YC1、YC2未能检测到LuxR1、LuxR2、GroEL、AMT、GAPDH基因。全基因组测序结果显示,RA、RC、RS菌株的基因组大小分别为2129862,2172619,2067830 bp,G+C含量分别为35.03%,35.09%,34.96%,蛋白编码基因数量分别为2022,2057,1923。遗传多样性分析结果显示,阳性扩增基因序列与标准菌株ATCC1848相对应的序列的同源性均在93%以上,其中TCTR、GroEL、LuxR1、IS1、DtxR、TR、TbdR1、TbdR2基因在阳性菌株中的同源性均在96%以上,而CAMP、Hema基因则存在较强的遗传多样性;3株非致病菌株DX1、YC1、YC2的OmpA、LipidA、Hema、CAMP、TbdR1、TbdR2、DtxR基因与其他菌株的同源性均在95%以上。全基因组序列比对分析显示,血清Ⅰ型菌株RC与CH3、RA-CH-1处于同一分支,血清Ⅱ型菌株RA、RS与RA-GD、RA-SG、RA-YM、ATCC11845菌株属于同一分支,同为血清Ⅱ型的RA、RS RA-CH-2菌株处于不同的遗传节点上。以上研究结果表明,鸭疫里默杆菌基因组存在遗传学多样性,OmpA、CAMP为鸭疫里默杆菌的非必需毒力因子,且某些优势血清型表型基因在鸭疫里默杆菌群体中发生了缺失,推测鸭疫里默杆菌的毒力因子间可能存在协同作用和网络调控。

鸭疫里默氏杆菌三磷酸甘油醛脱氢酶与鸭血浆蛋白的结合作用

为了探讨鸭疫里默氏杆菌(R.anatipestifer)感染引起鸭炎性渗出反应的分子基础及可能机制,阐明R.anatipestifer感染致病的分子机理,本研究采用Dot-ELISA、Western blot和质谱技术分析R.anatipestifer分泌的三磷酸甘油醛脱氢酶(RaGAPDH)与鸭血浆蛋白成分的结合作用,以及R.anatipestifer感染鸭血浆蛋白成分的变化。结果显示,重组RaGAPDH可与鸭血浆中的纤溶酶原和富组氨酸糖蛋白(histidine-rich glycoprotein, HRG)结合,R.anatipestifer感染鸭血浆α2-巨球蛋白(α2-macroglobulin,α2-M)和α1酸性糖蛋白(α1 acidglycoprotein,α1-AG)含量显著增高(P<0.05), HRG含量显著下降(P<0.05)。推测R.anatipestifer产生的具有酶活性的GAPDH同源体RaGAPDH能与动物血浆纤溶酶原和HRG发生结合,这种结合可能导致其血液凝固系统/纤溶系统的平衡紊乱和抗凝血机能下降;R.anatipestifer感染可引发动物肝脏急性炎性反应和严重损伤,血浆α2-M、α1-AG含量显著增高和HRG含量显著下降(P<0.05),可能导致动物血液凝固系统/纤溶系统平衡的自我调节能力下降。但RaGAPDH能否引发动物弥漫性血管内凝血和微血栓的形成,以及R.anatipestifer感染引发的HRG含量水平显著下降是否与其分泌表达的RaGAPDH有关,还有待进一步研究证实。