广藿香青枯病菌低致病力突变株的遗传稳定性研究

目的对广藿香青枯病菌低致病力突变株进行遗传稳定性评价。方法以广藿香青枯菌菌株PRS-84(对照)及通过Tn5转座子插入获得的低致病力突变株PRS-84-4-7、PRS-84-4-49为供试菌株,分别继代培养至100代;以Tn5转座子上的Kanr基因设计引物,对继代突变株进行PCR验证,并根据Tn5转座子序列设计引物,通过反向PCR检测转座子插入位点,以考察突变株基因组中Tn5转座子的遗传稳定性;通过观察菌体形态,并测定生长曲线、运动性、生物膜形成能力及致病性,考察突变株继代前后表型的变化。结果Tn5转座子在继代100代的低致病力突变株基因组中仍稳定存在,且插入位点不变;继代对低致病力突变株的菌体形态、生长速率、运动性、生物膜形成能力及致病力没有明显的影响。结论通过Tn5转座子插入突变获得的低致病力突变株具有良好的遗传稳定性,为研发防治广藿香青枯病的生防菌株奠定基础。

广藿香青枯病菌Tn5转座子插入突变体的构建

该研究以从感染了青枯病的广藿香植株中分离的青枯菌菌株PRS-84为供试菌株,利用电击转化法,对青枯菌进行Tn5转座子插入突变,在含卡那霉素的培养基上筛选抗性克隆。对抗性克隆进行卡那霉素抗性基因的PCR鉴定,并利用反向PCR技术获得转化子Tn5转座子插入位点的侧翼序列并进行序列测定与分析。结果表明,青枯菌感受态细胞经电击转化后,获得了抗性克隆。经PCR扩增,抗性克隆在预计的约700 bp处出现特异性条带。反向PCR扩增获得了转化子Tn5转座子插入位点的侧翼序列,经序列测定及同源性分析,初步推测3个突变体的Tn5转座子插入位点基因分别为typ A基因、rec O基因和gid A基因。该研究建立了广藿香青枯病菌Tn5转座子插入突变体系,获得了青枯菌Tn5转座子插入突变体,为构建广藿香青枯菌突变体库及发现青枯菌致病基因奠定了基础。

广藿香青枯病菌致病相关基因RsgidA的克隆及生物信息学分析

目的对广藿香青枯菌菌株PRS-84的致病相关基因RsgidA进行克隆及生物信息学分析。方法以广藿香青枯病菌Tn5转座子插入的低致病力突变株PRS-84-4-7为材料,对广藿香进行致病性实验;以Tn5转座子序列为基础,对突变株PRS-84-4-7的基因组进行反向PCR扩增,克隆转座子插入位点的侧翼序列;根据序列的同源基因设计特异性引物,对野生菌株PRS-84的基因组进行PCR扩增,对克隆获得的目标基因序列进行生物信息学分析。结果低致病力突变株PRS-84-4-7对广藿香的致病性不明显。成功获得了低致病力突变株转座子插入位点的侧翼序列,该序列与gidA基因的相似度最高,将插入位点基因命名为广藿香青枯病菌RsgidA基因。从野生菌株PRS-84中克隆了致病相关基因RsgidA,全长1881bp,编码626个氨基酸。系统进化分析显示,RsgidA基因编码蛋白与植物病原中丁香假单胞菌Pseudomonassyringae的GidA蛋白亲缘关系较近。结论从广藿香青枯病菌菌株PRS-84中成功克隆了致病相关基因RsgidA,为了解青枯病菌的致病机制、研究新的防治广藿香青枯病的方法奠定了基础。