C端结构域截短提高苏云金芽孢杆菌来源几丁质酶的活力

【目的】尝试利用蛋白质结构域工程的手段优化苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis BMB 171)来源的几丁质酶BtChiA的酶活力,并对水解胶体几丁质的产物进行定性和定量分析。【方法】根据BtChiA的序列分析其结构域的组成,构建BtChiA及部分结构域缺失的突变体蛋白在大肠杆菌中的表达菌株并进行蛋白的表达纯化;利用HPLC分析几丁质酶水解产物的类型及含量。【结果】异源表达纯化获得了纯度90%以上,大小正确的BtChiA (全长蛋白)和BtChiA△50 (截短几丁质结合结构域CBD和纤连蛋白结构域FnⅢ)。BtChiA△50水解胶体几丁质的活力是BtChiA的1.64倍。两者水解胶体几丁质的产物均为几丁单糖GlcNAc和几丁二糖(GlcNAc)2,全长蛋白BtChiA的水解产物中(GlcNAc)2的含量是GlcNAc的0.97倍,BtChiA△50水解产物中(GlcNAc)2的含量是GlcNAc的1.79倍。【结论】利用蛋白质结构域工程构建了水解活性提高的BtChiA△50突变体、优化了水解产物的组成。

BCG_3174基因敲除卡介苗菌株的构建及鉴定

目的为了证实BCG_3174是BCG基因组中存在的潜在抑制凋亡功能基因,拟构建BCG_3174敲除菌株并进行鉴定。方法以BCG中国株的基因组DNA为模板,PCR扩增BCG_3174基因,扩增产物用Van91Ⅰ酶切并回收产物。载体p0004S转化E.coli DH5α培养,用Van91I酶切载体p0004S。将酶切BCG_3174基因片段的左、右臂以及酶切载体p0004S的3.6 kb和1.6 kb两个片段连接,转化入DH5α中培养,筛选阳性克隆并测序鉴定,构建重组质粒p0004S-ΔBCG_3174。将载体phAE159转化E.coli HB101培养,提取phAE159后以PacI酶切,同时以PacI酶切重组质粒p0004S-ΔBCG_3174,以T4连接酶连接。加入E.coli HB101感受态细胞并培养,提取质粒后用PacI酶切鉴定,阳性克隆命名为phAE159-ΔBCG_3174,电击转化耻垢分枝杆菌mc2155感受态细胞。取BCG菌液与噬菌体裂解液混合共培养,提取敲除菌株的基因组DNA,鉴定正确的菌株命名为ΔBCG_3174。结果凝胶成像显示扩增产物与预期目标大小一致,左臂大小为887 bp,右臂大小为931 bp。阳性克隆测序确证左、右臂正确连入p0004S且序列无突变,p0004S-ΔBCG_3174序列与预期一致。PacⅠ酶切phAE159载体产生约42 kb和4 kb两条片段,酶切p0004S-ΔBCG_3174质粒产生7.1 kb片段,该片段亚克隆入PacⅠ酶切的phAE159载体后产生重组质粒phAE159-ΔBCG_3174,酶切鉴定证实phAE159-ΔBCG_3174构建正确。BCG_3174基因敲除的BCG基因组PCR扩增产物大小约为5.6 kb,与预期大小相符,BCG_3174基因敲除BCG菌株ΔBCG_3174构建成功。结论成功制备BCG_3174基因敲除的BCG菌株ΔBCG_3174,为BCG_3174基因的功能研究奠定了基础。