NURR1基因修饰C17.2神经干细胞移植治疗脑梗死

目的:比较C17.2神经干细胞和NURR1基因修饰的C17.2神经干细胞移植治疗对脑梗死模型鼠神经功能缺损的改善效果,观察细胞移植后与宿主脑组织的整合、存活、移行及分化情况。方法:实验于2005-06/12在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成。①实验材料:选取清洁级健康SD雄性大鼠78只,随机数字表法分为模型对照组、神经干细胞组、转基因神经干细胞组,26只/组。条件永生化神经干细胞系C17.2由哈佛大学儿童医院Even Synder教授惠赠。pAdeasy-NURR1重组复制缺陷性腺病毒由本实验室成功构建。Dil18荧光染料(Chemicon公司产品)。②实验方法:收集C17.2神经干细胞和pAdeasy-NURR1+C17.2神经干细胞,各分为两管,一管加入Dil18荧光示踪剂。各组大鼠均采用线栓法建立局灶性脑缺血/再灌注损伤模型,3d后进行细胞移植,以江湾Ⅱ型脑立体定向仪进行立体定位,选择缺血半暗区3个位点为移植区:前囟头侧1mm,旁开2mm,深度1.2mm;前囟尾侧3mm,旁开1.5mm,深度1.2mm;前囟尾侧6mm,旁开2mm,深度1.2mm。模型对照组每位点注射单纯培养液2μL;神经干细胞组取6只每位点移植Dil18标记的C17.2神经干细胞悬液2μL,剩余20只每位点移植C17.2神经干细胞悬液2μL;转基因神经干细胞组取6只每位点移植Dil18标记的pAdeasy-NURR1+C17.2神经干细胞悬液2μL,余20只每位点移植pAdeasy-NURR1+C17.2神经干细胞悬液2μL。③实验评估:各组大鼠分别在移植前1d及移植后1周、2周、1个月进行神经功能缺损评分。移植后1周、2周、1个月进行荧光示踪检查及神经元特异烯醇化酶免疫组化检测。移植后6个月行组织学检查。结果:移植后1周,模型对照组死亡1只,神经干细胞组死亡2组,转基因神经干细胞组死亡2只,均淘汰并予以补充。①神经功能缺损评分:移植前1d各组大鼠神经功能缺损评分基本相似(P>0.05)。移植后1周、2周、1个月神经干细胞组、转基因神经干细胞组神经功能缺损评分均明显低于模型对照组(P<0.05);转基因神经干细胞组下降趋势较神经干细胞组更为显著(P<0.05)。②Dil18荧光细胞示踪结果:移植后1周荧光示踪细胞主要在针道内,少数细胞开始移行至周围神经组织。移植后2周,细胞移行至更远距离,并明显向梗死灶方向移行,细胞有突触样结构与周围细胞形成联系。移植后1个月细胞向周围扩散,甚至在远隔部位也可见荧光细胞。③神经元特异烯醇化酶免疫组化检测结果:移植后2周、1个月,转基因神经干细胞组神经元特异烯醇化酶阳性细胞数均明显高于神经干细胞组(P均<0.05)。④细胞组织学检查:移植后6个月,各组大鼠注射针道周围脑组织仍呈正常的层次和结构,未见有明显异型细胞增生。结论:①NURR1基因修饰的C17.2神经干细胞移植治疗局灶性脑梗死能显著改善神经功能缺损,效果优于C17.2神经干细胞。②移植后供体细胞存活并向注射针道周围神经组织移行,促进神经干细胞向神经元方向的分化。

巴曲酶治疗急性脑梗塞的临床研究

目的:研究巴曲酶治疗急性脑梗塞的临床疗效、安全性,及其对血液流变学、凝血功能的影响。方法:按照单盲、随机、对照的研究方法,将68例急性脑梗塞患者随机分为治疗组33例,对照组35例。其中对照组采用常规治疗方法,治疗组在常规治疗方法的基础上加用巴曲酶治疗。观察疗效及安全性。结果:治疗组总有效率为84.85%,与对照组总有效率60%比较,差异有显著性(p<0.05)。治疗组治疗后血浆纤维蛋白原、全血粘度、血浆粘度、血小板粘附率的变化与对照组比较,差异有显著性(p<0.05)。无明显副作用。结论:急性脑梗塞使用巴曲酶治疗能提高好转率,降低患者血粘度和血纤维蛋白原浓度,安全性高。

巴曲酶治疗急性脑梗死的临床研究

目的:研究巴曲酶治疗急性脑梗死的临床疗效、安全性,及其对血液流变学、凝血功能的影响。方法:按照单盲、随机、对照的研究方法,将68例急性脑梗塞患者随机分为治疗组33例,对照组35例。其中对照组采用常规治疗方法,治疗组在常规治疗方法的基础上加用巴曲酶治疗。观察疗效及安全性。结果:治疗组总有效率为84.85％,与对照组总有效率60％比较,差异有显著性(P<0.05)。治疗组治疗后血浆纤维蛋白原、全血粘度、血浆粘度、血小板粘附率的变化与对照组比较,差异有显著性(P<0.05)。无明显副作用。结论:急性脑梗塞使用巴曲酶治疗能提高好转率,降低患者血粘度和血纤维蛋白原浓度,安全性高。

羟基红花黄素A对脑缺血再灌注后缺血半暗带自噬活性的调节作用

目的:探讨脑缺血再灌注后羟基红花黄素A(hydroxysafflor yellow A,HYSA)对缺血半暗带自噬活性的调控机制。方法:构建雄性SD大鼠脑缺血90 min再灌注模型,分为假手术组、脑缺血再灌注(cerebral ischmia/reperfusion,I/R)组、I/R+HSYA组和假手术+HSYA组,分别在再灌注后6 h、1 d、3 d和7 d对大鼠进行改良神经功能缺损评分(modified neurological severity score,m NSS),同时检测缺血半暗带的自噬活性、凋亡及干扰素β(IFN-β)表达。结果:与假手术组比较,I/R组缺血半暗带在6 h^7 d内可见LC3-Ⅱ蛋白表达增高及SQSTM1/P62蛋白降解,提示自噬激活;与I/R组比较,I/R+HSYA组的自噬活性在1 d和3 d时明显升高(P<0.05),7 d时则明显降低(P<0.05)。同时,I/R组的IFN-β表达较假手术组在6 h时升高(P<0.05),1 d和3 d时降低(P<0.05),7 d时恢复正常;而I/R+HSYA组的IFN-β表达在1 d和3 d时明显高于假手术组和I/R组(P<0.05),并且3 d时的细胞凋亡少于I/R组,m NSS评分自4 d起明显低于I/R组(P<0.05)。结论:HSYA可动态调节缺血半暗带的自噬活性和IFN-β表达,从而改善脑缺血再灌注损伤。

6-羟基多巴对C17.2神经干细胞毒性及NURR1基因对其保护作用

【目的】初步鉴定C17.2神经干细胞的特性并研究不同浓度6-羟基多巴对C17.2神经干细胞毒性及NURR1基因对C17.2神经干细胞的保护作用。【方法】免疫组化检测神经干细胞特异性抗原nestin,X-gal染色检测LacZ基因的表达,流式细胞仪检测剂量为0.02、0.04、0.06g/L6-羟基多巴在添加含有NURR1基因的重组复制缺陷性病毒前后诱发神经干细胞的坏死和凋亡。【结果】C17.2神经干细胞nestin抗原染色阳性,绝大部分细胞呈X-gal染色阳性,0.02g/L时6-羟基多巴以诱导神经干细胞凋亡为主,随着剂量增加,细胞坏死增多,0.06g/L时则以神经干细胞的坏死为主,NURR1基因过表达能明显减少神经干细胞的坏死和凋亡。【结论】C17.2神经干细胞具有明显的特性,6-羟基多巴诱发的C17.2神经干细胞凋亡或坏死与其剂量有关,NURR1基因对神经干细胞有保护作用。

大鼠脑梗死后缺氧组织显像的动态变化

【目的】研究大鼠脑梗死后缺氧组织是否能长期存在及其动态变化。【方法】利用大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,分别采用99Tcm-HL91放射自显影和EF5免疫荧光的方法进行缺氧显像。分持续缺血组(PI)、1.5h缺血再灌注组(1.5hIR)、2h缺血再灌注组和3h缺血再灌注组4组,放射自显影的观察时间点选取手术后1d和14d,免疫荧光则选取术后1、3、7、14、21d,每个时间点各3只大鼠。【结果】放射自显影显示1.5hIR组手术后1d和14d均为缺氧阳性,其余各组均阴性;免疫荧光示1.5hIR组术后1、3、7和14d均有缺氧组织,面积(μm2)有缩小倾向(分别为21478±8254、4405±1490、2647±463和1612±239),但荧光强度没有明显减弱(分别为1.66±0.07、1.75±0.02、1.68±0.08和1.64±0.01);而其余各组在术后7d均已无缺氧组织。【结论】与人类脑梗死相似,大鼠脑梗死后缺氧组织可存在较长时间,且随着时间的延长而逐渐减少;1.5hIR的大鼠MCAO模型是研究脑梗死后缺氧组织长时间存在的合适模型。

含有NuRR1基因的重组复制缺陷性腺病毒的构建和鉴定

[目的]构建并鉴定携带NURR1基因的重组复制缺陷腺病毒高效表达载体,为基因调控神经于细胞分化后治疗 帕金森病奠定基础。[方法]将测序鉴定正确的NURR1基因插入穿梭质粒pTrack-CMV后,与Adeasy整合,重组Adeasy质粒在 肾293A细胞内包装成病毒,PCR鉴定并测定病毒滴度,电镜鉴定病毒颗粒。[结果]成功构建的穿梭质粒pTrack-CMV-MURR1 与pAdeasy整合后,重组Adeasyr质粒在肾293A细胞内包装和复制时,细胞病变效应(cytopathogenic effect,CPE)明显,PCR鉴 定病毒DNA中有NURR1基因,病毒滴度测试表明病毒含量高,电镜显示病毒为多面体。[结论]成功构建出含有NURR1基因 的重组复制缺陷性腺病毒表达载体。

神经节苷酯对大鼠脑放射后学习记忆力下降的影响

目的 :研究神经节苷酯 (GM1 )对脑放射后学习记忆能力减退鼠空间学习记忆的影响。方法 :60只SD大鼠头部接受6 0 Coγ射线照射 ,7Gy 次 ,1次 天 ,连续照射 6d,总剂量 42Gy,照射鼠分 3组 ,每组2 0只 :照射后GM1治疗组 ;照射后生理盐水 (NS)治疗组 ;照射后未干预组。另设 2 0只鼠为对照组 ,麻醉后不予照射。照射结束后采用Morris水迷宫测定大鼠的学习记忆能力 ,迷宫试验结束后断头取脑 ,观察脑组织病理改变。结果 :GM1治疗组大鼠寻找平台潜伏期较照射后未干预组及NS治疗组缩短 ,但仍长于正常对照组。GM1治疗组大鼠平台象限游泳距离百分比高于照射后未干预组及NS治疗组 ,但较正常对照组低。组织学检查显示照射后大鼠脑组织神经细胞变性坏死 ,GM1治疗组病理改变较NS治疗组轻。结论 :放射性脑损伤可使鼠的学习记忆能力明显下降 。

^(99)Tc^m-HL91 SPECT脑显像显示急性脑梗死患者存活脑组织的初步研究

目的 观察99Tcm-HL91 SPECT脑显像能否显示急性脑梗死的乏氧组织(处于缺血缺氧状态但尚存活的脑组织)。方法 起病96小时内的大脑半球梗死患者行99Tcm-HL91 SPECT脑显像和同机CT扫描,并进行图像融合。在连续2个以上层面和两个以上不同轴向断层上,在梗死侧大脑半球出现放射性浓集区,为乏氧显像阳性。结果43例患者中,乏氧显像阳性者24例,均属完全或部分前循环梗塞。乏氧显像区位于梗死灶周围。9例住起病后7～17天复查SPECT,仍呈阳性,但乏氧组织已减少。腔隙性梗死者,乏氧显像均阴性。结论99Tcm-HL91 SPECT显像能清晰地显示完全及部分前循环梗塞患者的脑乏氧组织,能提示急性脑梗死后脑组织的存活,有助于指导治疗。

力抗栓与糖皮质激素联合治疗放射性脑病的临床研究

目的 探讨抗凝疗法对放射性脑病的治疗作用。方法 选择放射性脑病５７ 例随机分为治疗组（ 力抗栓０－２５／ｄ 合用激素） 及对照组（ 单用激素） ，两组病人在治疗前和治疗３ 个月后分别作临床评分，凝血３ 项等检查。结果 治疗组病人在３ 个月后总有效率达８３－０ ％ ，明显高于对照组的有效率（５６－０ ％ ） ，血粘度，ＰＡ，ＡＰＴＴ，ＦＩＢ均有明显下降。结论 力抗栓配合激素治疗，通过改变微循环能有效地控制放射性脑病。

人血管内皮生长因子165基因腺病毒载体的构建及其在C17.2神经干细胞的表达

【目的】构建含有人血管内皮生长因子165(VEGF_(165))基因的重组腺病毒载体并观察其在 C17.2神经干细胞的表达,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供基础。【方法】将 VEGF_(165)基因克隆至腺病毒穿梭质粒 pAdTrackCMV,获得重组质粒 pAdTrack VEGF_(165)。经酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒 pAdEasy 共同转染大肠杆菌 BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒 pAdCMV VEGF_(165),转化体外培养的 C17.2神经干细胞。通过 RT-PCR、原位杂交、免疫组化、Western blot 法检测其在 C17.2神经干细胞中的表达。【结果】重组腺病毒 AdCMV VEGF_(165)在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×10^(11)efu/mL。病毒上清液经 ELISA 检测VEGF_(165)表达的量为(1135±138)ng/L。重组腺病毒转染神经干细胞后有稳定表达。【结论】成功构建 pAd VEGF_(165)重组腺病毒,获得了稳定表达 VEGF_(165)的神经干细胞克隆,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供了基础。

用经皮钻颅血肿抽吸法治疗脑出血

为了探讨一种简易有效的治疗脑出血的手术方法，对本院近５年来治疗的１０６例高血压性脑出血病例，采用床边经皮钻颅一次性抽吸法进行治疗，总有效率达８７．７％，近期基本治愈率及显著进步率达７２．６％，比传统内外科治疗方法及国内同类方法疗效更高。本法经解剖实验证实定位准确，临床使用穿刺成功率达１０％。

^(99)Tc^m-HL91 SPECT功能显像对急性脑梗死患者脑乏氧组织的评估价值(英文)

背景:脑梗死后坏死灶边缘可能存在存活的缺血半暗带组织,该组织的存在与否对指导治疗、评估病情预后有重要参考价值。目的:观察99Tcm-HL91SPECT脑显像能否显示急性脑梗死患者梗死灶外周处于缺血缺氧状态但尚存活的脑组织。设计:病例分析。单位:中山大学附属第二医院神经科,核医学科和中山大学附属第一医院神经科。对象:2002-09/2003-05中山大学附属第二医院收治的发病96h内的大脑半球梗死患者43例,男20例,女23例,39例为首次发病,4例为再次发病。干预:患者行99Tcm-HL91SPECT脑显像和同机CT扫描,并进行图像融合。主要观察指标:在连续2个以上层面和2个以上不同轴向断层上,梗死侧大脑半球出现放射性浓集区,为乏氧显像阳性。结果:43例患者中,乏氧显像阳性者24例,均属完全或部分前循环梗死,分别有8例和16例。乏氧显像区位于梗死灶周围。9例在起病后7～17d复查SPECT,仍呈阳性,但乏氧组织已减少。12例部分前循环梗死患者和全部腔隙性梗死患者(7例),乏氧显像均阴性。结论:99Tcm-HL91SPECT显像能清晰地显示完全及部分前循环梗死患者的脑乏氧组织,能提示急性脑梗死后脑组织的存活,有助于指导治疗及早期康复干预。

人血管内皮生长因子165基因转染对C17.2神经干细胞体外增殖分化的影响

目的:构建含有人血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒载体,并观察其对C17.2神经干细胞体外增殖和分化的影响。方法:将血管内皮生长因子165基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,经酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠杆菌BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒pAdCMV血管内皮生长因子165,转染体外培养的C17.2神经干细胞。以单纯携带绿色荧光蛋白腺病毒转染为对照1组。通过酶联免疫吸附测定检测其在C17.2神经干细胞中不同时间段的表达。C17.2神经干细胞培养24h后,将pAdCMVGFP和pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17.2神经干细胞(pAdCMV绿色荧光蛋白和pAdCMV血管内皮生长因子165转染组),24,48,72h后每孔加入四氮唑盐10μL,检测pAdCMV转染对C17.2神经干细胞增殖的影响。将未进行pAdCMV绿色荧光蛋白,pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17.2神经干细胞设为对照2组。收集C17.2神经干细胞(C17.2神经干细胞组)和已经转染pAdCMVVEGF165的C17.2神经干细胞(pAdCMV血管内皮生长因子165的C17.2神经干细胞组),对两组细胞进行培养,将上述细胞爬片进行多聚甲醛固定,行巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶免疫组化法检测。结果:①重组腺病?

脑梗死后乏氧组织长时间存在的意义探讨

目的本研究通过观察脑梗死后长时间存在的乏氧组织与患者病情、预后的关系,探讨其意义。方法46例起病14 d内的完全或部分前循环梗死的患者,行99mTc-HL91 SPECT脑乏氧显像及同机CT扫描。在乏氧显像当天和起病21 d行美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分,在起病30 d和90 d行修订的Barthel指数(MBI)和修订的Rankin量表(MRS)评分。比较乏氧显像阳性与阴性患者的NIHSS、MBI、MRS评分,分析乏氧组织体积与这些评分的相关性。结果①30例患者乏氧阳性;②乏氧显像时NIHSS评分值及其与起病21 d时的NIHSS评分的差值在乏氧阳性与阴性者之间有统计学意义的差异(P=0.04,0.00)。该差值与乏氧组织体积和脑梗死亚型呈线性关系(β=0.02,1.58;P=0.02,0.03);③乏氧组织体积与起病90 d MBI、MRS评分呈等级相关性(r=0.39,P=0.03;r=-0.39,P=0.03)。乏氧组织体积与起病90 d MRS评分呈线性关系(β=-0.01;P=0.02)。结论脑梗死后存在的乏氧组织可作为估计患者早期病情好转的一个新指标,而且可能有助于预后的改善。

含NURR1基因腺病毒对神经干细胞分化的影响

目的含NURR1基因的重组腺病毒对神经干细胞分化的影响。方法免疫组化观察转染腺病毒后C17·2神经干细胞后分化效率。结果含NURR1基因的重组腺病毒可使C17·2神经干细胞分化后近76%细胞表现为神经元显型。结论含NURR1基因的腺病毒能明显的提高神经干细胞的分化效率。

速避凝治疗急性脑梗死的临床观察

目的:观察速避凝对急性脑梗死的疗效与安全性。方法:采用单盲、随机对照方式,将97例急性脑梗死患者分为治疗组51例,对照组46例。其中对照组用传统治疗,治疗组除传统治疗外,加用速避凝治疗10天。观察两组的治疗效果及副作用。结果:治疗组总有效率为88.25％,与对照组的63.03％比较有明显差异(P<0.05);治疗后全血粘度、血浆粘度、红细胞压积、血小板粘附率都有明显改变(P<0.05)。无继发出血等副作用。结论:速避凝治疗急性脑梗死疗效好,副作用少。

人血管内皮生长因子165慢病毒载体的构建及其抗放射所致细胞凋亡的作用

【目的】构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPhVEGF165,并转染至HT22细胞,并进一步观察其对放射线损伤所致的细胞凋亡的保护作用。【方法】PCR扩增hVEGF165基因,克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体;通过酶切电泳,菌落PCR初步筛选和测序鉴定构建的pCDH-CMV-MCS-EF-GFP1-hVEGF165重组载体;采用磷酸钙共转染法转染293T细胞包装制备慢病毒液,并感染HT22细胞,采用实时RT-PCR及Western Blot检测hVEGF165基因在HT22细胞中的表达情况。进一步对单纯HT22细胞、空质粒转染组以及hVEGF165转染组HT22细胞进行0、5、10 Gy的X线照射,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】hVEGF165基因片段重组到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体,酶切后电泳结果显示均能得到与理论大小相符的片段,测序结果与GenBank序列完全一致,转染HT22后hVEGF mRNA及蛋白表达水平明显增高。而且同各对照组相比,hVEGF165可以降低细胞放疗后的凋亡率。【结论】pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-hVEGF165慢病毒表达载体构建成功,其转染HT22细胞后可获得高水平hVEGF165 mRNA和蛋白的表达,hVEGF165具有抗放射所致细胞凋亡的作用。

医学诊断学实习教学的一些体会

文章对医学诊断学教学中的一些体会进行了总结 ,指出在教学过程中 ,应该强化基本功训练 ,采用多种教学方法提高教学效果 ,以及加强医德医风教育和理论联系实际的重要性 ,以此达到全面提高学生素质的目的。