猴痘病毒A5L蛋白的原核表达及其免疫原性评价

【目的】获取高纯度猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)A5L蛋白,制备小鼠抗A5L高效价抗血清,为MPXV A5L蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】构建重组质粒pET-28a-A5L,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,通过分析不同IPTG诱导浓度、诱导温度、诱导时间条件下重组蛋白A5L表达情况,筛选最佳表达条件。通过Western blotting鉴定重组蛋白A5L表达,利用SDS-PAGE分析重组蛋白可溶性。A5L蛋白经His-Bind镍柱亲和层析纯化后免疫小鼠,通过ELISA法检测抗体效价。【结果】双酶切和测序结果显示,原核表达载体pET-28a-A5L构建成功。Western blotting结果显示重组蛋白A5L在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达;A5L蛋白在诱导温度42℃、诱导剂(IPTG)浓度为1.6 mmol/L、诱导16 h后表达量最高,大小为40 ku。SDS-PAGE分析结果显示,A5L蛋白主要以包涵体形式存在,最佳咪唑洗脱浓度为50 mmol/L。ELISA结果显示,制备的鼠抗A5L蛋白抗体最高效价达1∶205 440。【结论】本研究成功构建了重组质粒pET-28a-A5L,并在原核表达系统中成功表达重组蛋白A5L,制备的A5L多克隆抗体具有较好的免疫原性,研究结果为进一步探究MPXV A5L蛋白的生物学功能奠定基础。

新型冠状病毒Omicron变异株RBD二聚体蛋白抗体的制备与鉴定

【目的】研究旨在构建新冠病毒Omicron变异株(B.1.1.529)RBD重组质粒pET-28a-RBD-dimer,利用E.coli BL21(DE3)原核细胞表达S-RBD二聚体蛋白并制备其多克隆抗体,用于研究Omicron变异株RBD的免疫学功能。【方法】运用Golden Gate无缝克隆技术将密码子优化的RBD二聚体基因克隆到pET-28a载体中,构建pET-28a-RBD-dimer重组质粒。经表达条件优化后,以镍离子亲和层析法分离纯化RBD二聚体蛋白。将纯化的蛋白作为免疫原制备鼠源抗RBD二聚体蛋白的多克隆抗体,利用间接ELISA、IFA及Western blotting试验技术分别检测多克隆抗体的效价和特异性。【结果】ELISA试验结果显示该多克隆抗体的效价高达1:256000,IFA及Western blotting试验结果表明该多克隆抗体可特异性识别原核、真核细胞表达的RBD二聚体蛋白以及商业化RBD蛋白,具有较好的特异性、反应原性和灵敏性。【结论】研究成功使用原核细胞表达Omicron RBD二聚体蛋白,其具有较好的免疫原性,可以有效制备具有较高抗体效价、特异性及灵敏度的多克隆抗体,为进一步研究原核表达的RBD二聚体蛋白的生物学功能,Omicron变异株的鉴别诊断和亚单位疫苗的开发提供依据。

猴痘病毒A23R蛋白的表达、纯化及其小鼠抗血清制备

目的 大肠杆菌细胞表达和镍柱纯化猴痘病毒(MPXV)A23R蛋白,制备小鼠抗MPXV A23R的高效价抗血清。方法构建重组质粒pET-28a-MPXV-A23R,并转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,优化蛋白表达条件后获得大量蛋白。镍柱纯化重组蛋白A23R并进行Western blot法鉴定。纯化后的A23R蛋白免疫小鼠,制备A23R多克隆抗体,采用ELISA检测抗体免疫滴度。结果 在0.6 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、诱导温度37℃、诱导20 h时,获得的A23R重组蛋白表达量最大,纯化后的蛋白纯度约为96.07%,经Western blot法鉴定为目的蛋白。重组蛋白免疫小鼠,第6周时IgG抗体的效价达到1∶102 400。结论 成功获得高表达和高纯度的重组A23R蛋白,并制备了小鼠抗MPXV-A23R的高效价血清。

猴痘病毒E2L蛋白的表达、纯化及免疫原性评价

【目的】构建猴痘病毒E2L蛋白原核表达载体,经诱导表达及纯化鉴定后免疫接种昆明小鼠评价其免疫原性,为猴痘病毒诊断试剂、疫苗和特异性治疗药物的研发打下基础。【方法】根据GenBank已公布的猴痘病毒基因组序列优化密码子后合成E2L基因,将其克隆至表达载体pET-28a(+)上构建原核表达载体pET-28a-E2L,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)受态细胞,采用控制变量的方法对融合蛋白最佳诱导表达条件进行优化,通过SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。融合蛋白经His-Bind柱亲和层析纯化后,经腹腔注射免疫昆明小鼠,从免疫当天(第0 d)开始每隔7 d通过断尾法采集昆明小鼠血清1次,采用ELISA检测血清抗体效价。【结果】以构建的原核表达载体pET-28a-E2L转化BL21(DE3)受态细胞后,经IPTG诱导,能成功表达获得融合蛋白E2L,且主要以包涵体的形式进行表达。融合蛋白E2L的最佳诱导表达条件为40℃下以1.0 mmol/L IPTG诱导16 h,通过His-Bind柱亲和层析纯化时的最佳咪唑洗脱浓度为100 mmol/L。昆明小鼠免疫试验结果表明,纯化后的融合蛋白E2L能诱导昆明小鼠产生较高水平的体液免疫,至免疫第42 d昆明小鼠血清仍然维持较高抗体水平,抗体效价高达1∶70400,说明融合蛋白E2L具有良好的免疫原性。【结论】猴痘病毒E2L蛋白在原核表达系统能实现高效表达,且以纯化后的融合蛋白E2L免疫昆明小鼠能产生较强的体液免疫,表明具有良好的免疫原性,可用于新型猴痘病毒检测方法及预防疫苗的研发。

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猴痘F3L蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的猴痘病毒(MPXV)是一种能引起人畜共患病的正痘病毒属病毒,在人群和野生动物中具有较高的感染率,对人类公共卫生安全造成重大威胁。当前猴痘病毒的相关研究基础较弱,猴痘诊断试剂匮乏。本研究旨在以猴痘病毒基因F3L为对象表达F3L重组蛋白并免疫小鼠,制备F3L多克隆抗体,为猴痘诊断试剂的研发奠定基础。方法克隆猴痘病毒基因F3L,构建至原核表达载体pET-28a上,测序无误后将重组质粒pET-28a-MPXV-F3L转化E.coli BL21感受态细胞,用优化的IPTG诱导表达条件表达MPXV-F3L重组蛋白,表达蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后采用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。用纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备F3L多克隆抗体血清,采用ELISA检测血清抗体滴度。结果克隆得到的猴痘病毒F3L基因片段长度为471 bp,表达的pET-28a-MPXV-F3L重组蛋白分子质量约为24.6 ku,其最佳表达条件为IPTG浓度0.2 mmol/L、温度42℃、时间12 h。表达蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后纯度达95.29%,经Western blot鉴定表达蛋白能被相应抗体识别。用该蛋白免疫小鼠,制备获得F3L多克隆抗体ELISA滴度为4.709。结论重组表达的F3L蛋白具有抗原性,免疫小鼠后能刺激产生高滴度的血清抗体,为F3L蛋白功能分析、猴痘病毒的致病机制研究以及诊断试剂和疫苗的开发奠定了基础。

呼吸道铜绿假单胞菌体外药敏试验研究

目的分析呼吸道铜绿假单胞菌体外药敏试验结果。方法分离481株铜绿假单胞菌,以琼脂稀释法进行体外药敏试验,根据最小抑菌浓度(MIC)判断铜绿假单胞菌及亚胺培南不敏感菌株的敏感性、耐药性及中介率。结果呼吸道铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药性最低(12.06%),对美罗培南的耐药性次之(13.93%),对复方新诺明耐药性最高(99.79%)。96株亚胺培南不敏感菌株对阿米卡星耐药性最低(16.67%),对复方新诺明耐药性最高(98.96%)。结论针对我院铜绿假单胞菌耐药性现状,建议以亚胺培南、环丙沙星等抗菌药物进行经验性治疗,在此基础上联用阿米卡星有望取得较好的疗效。

基于行动研究法康复模式在脑卒中急性期患者的构建和应用

目的研究基于行动研究法康复模式在脑卒中急性期患者的构建和应用效果。方法选取2018年5月至2019年10月岑溪市人民医院医治的脑卒中急性期患者110例为研究对象,按照入院先后顺序将其分为干预组和常规组各55例。常规组给予常规护理干预,干预组为患者构建基于行动研究法康复模式并实施,观察并比较两组干预前后的肢体功能、日常生活能力、生活质量的变化。结果对脑卒中急性期患者构建基于行动研究法康复模式及实施后,干预组的肢体功能显著高于常规组,干预组日常生活能力量表(ADL)评分显著高于常规组,干预组脑卒中患者生活质量评定量表(SS-QOL)评分明显高于常规组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论基于行动研究法康复模式的构建科学合理,且具有较好的操作性和实用性,使护理过程具有合作性、参与性、灵活性的特点,该模式的建立不仅可以明显改善脑卒中患者肢体功能,还提高其生活自理能力,进而促进脑卒中患者生活质量的改善,对脑卒中患者早期康复护理工作的开展具有指导意义。