人CDK14基因表达荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立一种人细胞周期蛋白依赖性激酶14(CDK14)基因表达荧光定量PCR检测方法。方法利用Trizol法提取不同人肺癌细胞株中总RNA,以β-Actin和CDK14分别为内参和目的基因,分别设计特异性扩增引物,建立人CDK14基因表达荧光定量PCR检测系统并评估其检测性能。同时将其应用于不同细胞系siRNA干扰前后的CDK14基因相对表达水平检测。结果经电泳分析、熔解曲线、产物测序确认人CDK14基因表达荧光定量PCR检测系统已建立,其特异性良好,重复性佳(CV=7.13%),线性范围较宽(CDK14与β-Actin分别在Ct值范围22.47~32.96与15.14~27,55间具有良好的相关性,r^2=0.9844。)。利用该体系检测发现:在HCC827 D5和H1650细胞中CDK14基因高表达;在1~3号干扰片段中,1号片段为有效片段。结论人CDK14基因表达荧光定量PCR检测方法已成功建立。

微阵列芯片Meta分析序列相似家族72成员A mRNA水平与乳腺癌预后关系

目的探讨序列相似家族72成员A(FAM72A)mRNA表达水平与乳腺癌患者预后的关系。方法在NCBI的GEO数据库中检索乳腺癌基因表达谱的数据集,对数据进行预处理后,对数据集进行标准化合并。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,采用单因素Cox模型分析乳腺癌患者以及不同分型乳腺癌患者的总体无事件生存期与FAM72A mRNA表达的相关性。结果总共纳入10个微阵列数据集,包含1 720例乳腺癌患者癌组织样本。在所有乳腺癌患者中,FAM72A mRNA高表达者无事件生存期低于FAM72A mRNA低表达者(P<0.05);在雌激素受体阳性乳腺癌患者中,FAM72A mRNA高表达者无事件生存期低于FAM72A mRNA低表达者(P<0.05);在乳腺管腔B型患者中,FAM72A mRNA高表达者无事件生存期低于FAM72A mRNA低表达者(P<0.05)。结论 FAM72可以作为预测乳腺管腔B型乳腺癌患者预后的潜在标志物。

华南地区非小细胞肺癌患者肿瘤组织EGFR,ALK和ROS1基因突变分析

目的探讨华南地区非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤组织表皮生长因子受体(EGFR),变性淋巴瘤激酶(ALK)和C-ros原癌基因1酪氨酸激酶(ROS1)基因突变特点及其与临床特征的关系。方法收集2016年11月～2017年6月间华南地区76例NSCLC患者肿瘤组织及相应临床资料,利用ARMS法三基因突变联合检测试剂盒检测各肿瘤组织的EGFR,ALK,ROS1基因突变状态,并做各基因突变率与临床特征的相关性分析。结果在华南地区76例NSCLC患者中,EGFR基因突变率为55.3%(42/76),19 del和L858R突变为其主要突变类型,检出1例19del联合L858R共突变;ALK基因融合阳性率为17.1%(13/76),检出4例ALK基因融合联合EGFR基因突变;ROS1基因融合的阳性率为1.3%(1/76),未见ROS1基因联合EGFR基因或ALK基因共突变。与ROS1基因相比,EGFR和ALK基因突变率更高,差异具有统计学意义(χ~2=54.515,P=0.000;χ~2=11.329,P=0.001)。非吸烟NSCLC患者EGFR基因突变率高于吸烟患者,差异具有统计学意义(χ~2=4.578,P=0.032),而ALK与ROS1基因突变率的差异则不具有统计学意义(χ~2=0.000,均P值>0.05);不同年龄、性别和组织学分型的NSCLC患者其EGFR,ALK与ROS1基因突变率的差异不具有统计学意义(χ~2=0.000～2.219,均P值>0.05)。结论 EGFR,ALK和ROS1基因突变均可见于华南地区NSCLC患者,其中以EGFR和ALK基因突变率更高。

miR-17-5p靶向PTEN促进非小细胞肺癌吉非替尼耐药

目的探讨miR-17-5p在NSCLC吉非替尼耐药中的作用。方法 QRT-PCR法检测miR-17-5p在细胞模型中的表达。MTS法检测细胞过表达或敲低miR-17-5p后的耐药性变化。预测miR-17-5p下游靶基因并通过双荧光素酶报告基因实验、功能阻断实验等证实miR-17-5p通过靶向PTEN基因介导对吉非替尼的耐药。QRT-PCR法检测耐药前后NSCLC患者血清中的miR-17-5p表达。结果 miR-17-5p在耐药细胞中表达增加(P <0.05)。敏感与耐药细胞中分别过表达和敲低miR-17-5p后,细胞对吉非替尼耐药性分别增加和降低(P <0.05)。发现PTEN为miR-17-5p下游靶基因,敲低PTEN后可逆转敲低miR-17-5p导致的耐药性降低。耐药后NSCLC患者血清中miR-17-5p表达升高。结论 miR-17-5p通过下调PTEN表达促进了NSCLC对吉非替尼的耐药。

Wnt信号通路转录上调EGFR促进非小细胞肺癌吉非替尼耐药

目的探讨Wnt信号通路和表皮生长因子受体(EGFR)在非小细胞肺癌(NSCLC)吉非替尼耐药中的作用及其机制。方法运用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和免疫印迹实验(Western blot)检测EGFR在亲代HCC827细胞与吉非替尼耐药细胞(HCC827/R)中的表达;免疫组化染色检测耐药前后3对NSCLC肿瘤组织中EGFR的表达。双荧光素酶报告基因实验(Luciferase)检测亲代HCC827细胞与耐药HCC827/R细胞Wnt信号通路活化情况;在Jaspar数据库中预测EGFR基因启动子区上TCF/LEF转录因子结合位点;染色质免疫共沉淀实验(Chip)和Luciferase实验检测转录因子对基因表达的调控;功能阻断实验检测Wnt信号通路/EGFR途径介导吉非替尼耐药的作用。结果与亲代HCC827细胞相比较,HCC827/R细胞的EGFR在mRNA和蛋白水平表达均明显增高(P<0.05)。免疫组化染色结果显示在3例吉非替尼耐药前后NSCLC配对肿瘤组织样品中有2例耐药后EGFR表达较耐药前增加。Luciferase实验结果显示,与亲代细胞比较,Wnt/β-catenin信号通路在耐药HCC827/R细胞中异常活化(P<0.05)。生物信息学分析预测到EGFR基因启动子区-1476^-1468区域存在Wnt/β-catenin信号通路下游转录因子TCF3/TCF4结合位点,Chip和Luciferase实验证实Wnt/β-catenin信号通路可转录上调EGFR表达。功能阻断实验结果显示当利用Wnt3a刺激亲代HCC827细胞的同时敲低EGFR,吉非替尼对细胞的抑制率较单独利用Wnt3a刺激细胞时的细胞抑制率得到恢复(P<0.05)。结论 Wnt/β-catenin信号通路转录上调EGFR促进NSCLC的吉非替尼耐药,其为提高NSCLC吉非替尼靶向治疗效果提供了新的实验依据。

非小细胞肺癌细胞株HCC827克隆异质性及其与吉非替尼敏感性的关系

目的观察非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株HCC827的克隆异质性,分析其与吉非替尼敏感性的关系。方法取对数生长期HCC827细胞,利用极限稀释法获得单克隆化HCC827子代细胞株,分为A、B、C、D、E、F组;另取对数生长期HCC827细胞,记为亲代细胞组。采用平板克隆形成实验观察各组细胞平板克隆形成数,采用细胞生长曲线实验观察各组细胞增殖倍数,观察细胞增殖能力异质性;采用细胞药敏实验观察各组细胞对吉非替尼敏感异质性;采用Sanger直接测序法检测各组细胞EGFR基因,采用荧光原位杂交实验检测各组细胞MET、HER2基因,观察各组细胞遗传异质性;采用细胞克隆混合实验观察吉非替尼对细胞异质性的动态影响。结果B组克隆形成数高于亲代细胞组(P<0.01),A、D、E组克隆形成数低于亲代细胞组(P均<0.05)。B、F组细胞培养48、72、96、120 h时的增殖倍数与亲代细胞组相比,P均<0.05;C、D组细胞培养72、96、120 h时的增殖倍数与亲代细胞组相比,P均<0.05;其中B组细胞增殖倍数最高,D组细胞增殖倍数最低。B组细胞为对吉非替尼最敏感的细胞组,其余各组细胞对吉非替尼的IC50值与亲代细胞组相比,P均<0.05,其中D组细胞为对吉非替尼IC50值最高的细胞组。亲代细胞组与A^F组细胞均为EGFR基因19 Del突变。D组细胞HER2基因扩增为阳性、MET基因扩增为阴性,而亲代细胞组和A、B、C、E、F组细胞HER2基因和MET基因扩增均为阴性。在吉非替尼压力下,吉非替尼敏感B克隆细胞和耐药D克隆细胞等比例混合培养2周后耐药细胞获得绝对生长优势,B克隆细胞与亲代细胞等比例混合培养2周后少量残留细胞中亲代细胞存在相对优势,D克隆细胞与亲代细胞等比例混合培养2周后两细胞均势生长。结论HCC827细胞在增殖能力、药物敏感性等表型层面和驱动基因等遗传背景层面均存在克隆异质性,并且其克隆异质性与吉非替尼敏感性有关。

长链非编码RNA RP11-214F16.8促进乳腺癌细胞增殖

长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)在乳腺癌发生发展中的作用备受瞩目。本研究通过大数据分析发现,lncRNA RP11-214F16.8在乳腺癌组织中的表达量显著高于正常组织,且其表达量与乳腺癌患者预后负相关。因此,本文采用qRT-PCR技术,在收集的临床样本中验证RP11-214F16.8的表达,证实其在乳腺癌组织中相对表达量为5.65±0.72,其在癌旁组织中表达量为2.63±0.35,且RP11-214F16.8的表达量与乳腺癌瘤体大小和临床TNM分期相关。此外发现,RP11-214F16.8在乳腺癌细胞中的表达量高于正常乳腺上皮细胞。在乳腺癌MCF-7细胞中,过表达RP11-214F16.8后,MCF-7细胞的增殖能力显著增强。而在MDA-MB-231细胞中,敲低RP11-214F16.8的表达,获得相反的结果。进一步研究发现,RP11-214F16.8可上调细胞周期蛋白D3、CDK4的表达,而下调p18蛋白表达量,进而加速细胞增殖。总之,RP11-214F16.8在乳腺癌中高表达,且促进乳腺癌细胞增殖,进而推动乳腺癌进程。这一研究发现,将为乳腺癌发生发展的网络机制研究提供新的理论依据。

Hsa-miR-17基因启动子区PCR扩增及鉴定体系的构建

目的建立Has-miR-17编码基因启动子区的PCR扩增及鉴定体系。方法提取人源细胞系基因组DNA为实验样本,以Has-miR-17编码基因上游启动子区序列为目标序列,行序列特征分析并设计特异PCR扩增及测序引物,利用添加DMSO和使用5’加尾引物的体系优化策略建立Has-miR-17基因启动子区PCR扩增及鉴定体系并行性能评估。同时另以10例人源细胞系为样本初步验证该PCR及鉴定体系的应用效果。结果经电泳鉴定与测序分析确认在联合使用5'加尾PCR引物和5%DMSO的条件下Has-miR-17基因启动子区PCR扩增及鉴定体系已成功建立,其检测下限达10 ng/μl且特异度好、重复性佳。利用该体系成功实现对10例人源细胞株Has-miR-17基因启动子区的PCR扩增及鉴定。结论已成功建立Has-miR-17编码基因启动子区的PCR扩增及鉴定体系。

人非小细胞肺癌NCI—H1975细胞的异质性研究

目的探讨人非小细胞肺癌NCI-H1975细胞的异质性及其与药物反应性的关系。方法利用有限稀释法获得NCI-H1975细胞单克隆化子细胞，并对母细胞和部分单克隆化子细胞行表型、药物反应性和表皮生长因子受体（EGFR）基因突变检测，分析NCI-H1975细胞的克隆异质性特征及其与药物反应性的关系。结果获得13个单克隆化的NCI-H1975子细胞，与母细胞相比，各子细胞在细胞增殖能力、吉非替尼敏感性和顺铂敏感性方面差异有统计学意义（P〈0．05），在EGFR基因突变状态方面未见差异。结论NCI-H1975细胞存在细胞增殖能力等表型指标和药物反应性指标的异质性，并与药物治疗的反应性和耐药相关。

奥希替尼耐药非小细胞肺癌细胞系的建立及耐药机制的初步研究

目的建立非小细胞肺癌(NSCLC)第三代EGFR-TKI奥希替尼(Osimertinib)耐药细胞系并初步探讨其耐药机制。方法以人NSCLC细胞系H1975为研究对象,利用低浓度奥希替尼持续诱导筛选继发耐药细胞系。MTS法检测细胞奥希替尼药物敏感性。活细胞工作站检测细胞增殖能力。流式细胞仪检测细胞周期与细胞凋亡。利用蛋白质谱检测数据构建亲代与耐药细胞的差异表达基因谱并通过qRT-PCR和Wester blot验证耐药相关基因。结果成功获得奥希替尼继发耐药H1975/OSI细胞。与亲代细胞相比,H1975/OSI细胞的耐药指数增加了27.25倍(P<0.01),细胞增殖能力降低但凋亡抗性增加(P=0.01)且未产生EGFR-TKI耐药常见相关基因的突变。同时建立起H1975与H1975/OSI细胞蛋白质差异表达谱,发现耐药细胞上调蛋白307个,下调蛋白295个,其中在H1975/OSI细胞中表达增加的成纤维细胞特异蛋白(FSP1)被干扰后,干扰细胞对奥希替尼的敏感性增加(IC50值下降3.51倍,P=0.02)。在亲代H1975细胞中过表达FSP1,奥希替尼对细胞的IC50值增加了3.75倍(P<0.01)。结论成功建立人NSCLC奥希替尼耐药细胞系H1975/OSI;成功构建H1975与H1975/OSI蛋白质差异表达谱;FSP1蛋白可能通过增加H1975/OSI的凋亡抗性介导奥希替尼耐药。