病理性近视脉络膜新生血管的诊断和治疗

病理性近视脉络膜新生血管(PM-CNV)是病理性近视的一大威胁视力的并发症,作为近视性黄斑病变的附加病变之一,其诊断和治疗越来越被临床所重视,最近数十年,治疗的目的已从防止视力的丧失向恢复下降的视力转变。PM-CNV的发病机制可能是复杂多因素的。相干光断层扫描(OCT)、荧光素眼底血管造影(FFA)和吲哚菁绿血管造影(ICGA)有助于其诊断,相干光断层扫描血管成像(OCTA)是检测复杂脉络膜新生血管(CNV)的非常有用的工具,可用于帮助作出治疗决定。抗血管内皮生长因子(VEGF)治疗现已成为PM-CNV的一线治疗,临床实践中多采用3+PRN或1+PRN方案,两种方案均有效。PM-CNV基线病变大小、病变的位置、黄斑脉络膜厚度、视网膜萎缩的发展和扩大以及发病年龄被认为是PM-CNV的预后因素。

Pim-3慢病毒质粒构建及其表达鉴定

目的构建Pim-3慢病毒质粒,鉴定其在卵巢癌SKOV3细胞中基因及蛋白水平的表达。方法 RT-PCR法提取Pim-3 cDNA,经T-A克隆及双酶切将其与慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP重组;酶切鉴定及基因测序后,将阳性重组质粒导入病毒包装细胞293T中;收集病毒上清液转染SKOV3细胞,荧光显微镜下观察转染情况,应用RT-PCR及Western blot法分别检测Pim-3 mRNA及其蛋白。结果 RT-PCR法获得Pim-3基因,重组质粒酶切后片段大小及基因测序结果显示pCDH/Pim-3重组质粒构建成功。将感染重组质粒及空载体的293T细胞生产的病毒上清分别感染SKOV3细胞,感染重组质粒的SKOV3细胞中Pim-3 mRNA及蛋白表达水平均高于空载体细胞。结论成功构建了pCDH/Pim-3重组慢病毒质粒,建立了Pim-3高表达SKOV3瞬转细胞模型,为探讨Pim-3在卵巢癌发生、发展中的作用及机制奠定实验基础。

LncRNA Tsix在NMDA诱导小鼠视网膜兴奋性毒性模型中的表达及其意义

目的研究不同剂量N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)溶液对小鼠视网膜神经节细胞(RGCs)的损伤作用,并检测新型长链非编码RNA(lncRNA)Tsix在小鼠视网膜兴奋性毒性模型中的表达水平及其对视网膜和RGCs的保护作用。方法选取7~8周龄C57B6/J小鼠105只,采用随机数表法将小鼠随机分为正常对照组、2 mmol/L NMDA组、10 mmol/L NMDA组、20 mmol/L NMDA组和40 mmol/L NMDA组,每组21只。正常对照组小鼠右眼玻璃体腔内注入1μl氯化钠溶液,不同剂量NMDA组分别注射相应剂量的NMDA溶液各1μl。1周后,分别采用光相干断层扫描(OCT)、苏木精-伊红染色、视网膜铺片和免疫荧光染色法分析不同剂量NMDA组视网膜各层厚度、神经节细胞层(GCL)细胞数量和RGCs数量。采用RNAscope原位杂交技术检测不同剂量NMDA组GCL中lncRNA Tsix的表达。采用实时荧光定量PCR技术检测不同剂量NMDA组Tsix基因的转录本水平。结果OCT结果显示,2、10、20和40 mmol/L NMDA组视网膜全层厚度分别为(255.00±6.63)、(252.40±6.41)、(248.67±6.20)和(229.11±10.37)μm,较正常对照组的(269.60±20.01)μm明显变薄,差异均有统计学意义(均P<0.05)。苏木精-伊红染色结果显示,正常对照组小鼠GCL细胞排列均匀、紧密,呈单层,细胞核大而圆,NMDA注射后细胞出现体积不均和空泡,有核固缩现象。各剂量NMDA组GCL细胞数量随NMDA剂量的增加而显著降低,与正常对照组相比差异均有统计学意义(均P<0.05)。当NMDA浓度增至20 mmol/L时,GCL的细胞数量减少至正常对照组的一半。视网膜铺片结果提示,β3-微管蛋白阳性RGCs细胞数量随NMDA剂量的增加显著降低,与正常对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.05);10 mmol/L NMDA组RGCs数量减少至正常对照组的一半。RNAscope结果显示,lncRNA Tsix主要在GCL细胞的细胞质中表达,且随着NMDA剂量的增加,表达lncRNA Tsix的阳性细胞率显著降低,各组总体比较差异有统计学意义(F=13.670,P<0.01)。实时荧光定量PCR结果验证Tsix随NMDA剂量的增加表达趋势与RNAscope结果一致。结论NMDA对视网膜厚度和RGCs的损伤呈剂量依赖性,小鼠视网膜lncRNA Tsix的表达主要集中在GCL细胞的细胞质,且转录本水平随着NMDA剂量的增加而降低,对RGCs发挥保护作用。

诺如病毒病毒样颗粒的表达及其与Caco-2细胞的结合活性研究

目的在杆状病毒表达系统转染的昆虫SF-9细胞中表达诺如病毒（NorovirUSes，NoV）的衣壳蛋白VPl，并芎令证其与Caco-2细胞的结合活性。方法利用杆状病毒表达系统转染的昆虫SF-9细胞进行诺如病毒VPl蛋白表达，用蔗糖密度梯瞍超速离心方法纯化，采用Westernblot鉴定表达产物，采用流式细胞术检测NoV病毒样颗粒（Virus-likeparticles，VLPs）与Caco-2细胞的结合活性。结果重组质粒转染细胞表达产物经蔗糖密度梯度超速离心后进行SDS~PAGE，在分子质量单位55~70ku之间有3条蛋白带，与预期重组蛋白NoV—VI-Ps大小相符；Westernblot分析各蛋白组分均能被兔抗NoV多抗血清识别；流式细胞仪分析届示，加入重组蛋白NoV—VI—Ps后荧光信号较阴性对照组显著增强，表明表达的重组蛋自NoV—VI．Ps能够与Caco-2结合，且3个组分的结合能力不同（P〈i0·05），以组分5与Caco-2细胞结合的能力最强（P〈O．05）。结论NoVVI．Ps表达成功，并证明NoV-VI—Ps具有与Caco2细胞结合活性，为N。V疫苗的开发和防治药物的研制奠定了基础。