Gly33的缺失和突变对hTrx-1抗氧化活性的影响

为探讨人硫氧还蛋白hTrx-1活性位点保守序列中Gly33残基在还原氧化性蛋白过程中是否必不可少,通过合成突变基因对hTrx-1的Gly33残基进行缺失和替换(G→A)。合成的突变基因随后在原核细胞中表达并进一步纯化及检测抗氧化活性,结果表明,无论是Gly33残基的缺失还是突变为Ala,突变的hTrx-1均能在原核细胞中高效表达,暗示2种突变型hTrx-1均能形成“Trx折叠”结构。抗氧化活性检测表明Gly33残基缺失的情况下,其抗氧化能力有所下降,当Gly33突变为Ala时,其抗氧化能力大幅下降到接近失去抗氧化能力。推测Trx-1活性中心保守氨基酸残基的改变影响了活性中心区域的几何构象,从而导致底物蛋白难以从空间上靠近。参与形成二硫键巯基的含量检测结果表明,突变型hTrx-1中形成二硫键巯基的含量明显低于野生型hTrx-1中形成二硫键巯基的含量,推测突变型hTrx-1的Cys32与Cys35形成二硫键的能力受到影响。

基于mtDNA-COⅡ基因序列对中国南海裸胸鳝属鱼类分子系统进化关系的研究

采用聚合酶链式反应直接测序法,获得细斑裸胸鳝、黄纹裸胸鳝、云纹裸胸鳝、黑点裸胸鳝、褐裸胸膳5种裸胸鳝属鱼类的细胞色素氧化酶Ⅱ（cytochrome oxidaseⅡ,COⅡ）基因序列（691 bp）。结合GenBank上蠕纹裸胸鳝COⅡ同源序列,采用多个生物软件对6种裸胸鳝属鱼类序列变异和碱基组成进行分析,共发现196个核苷酸位点存在变异（28.36%）;计算了它们的相对遗传距离、转换/颠换比等遗传信息指数,6种裸胸鳝属鱼类的序列差异为0.012~0.199,其中云纹裸胸鳝与褐裸胸鳝的序列差异最大,为0.199,细斑裸胸鳝与黄纹裸胸鳝序列的差异最小,为0.012;总体来说,序列中的转换明显多于颠换,转换和颠换的比值（Ts/Tv）为2.7;以长鳝为外群构建NJ、ME、MP系统树,长鳝分为独立的一支,6种裸胸鳝为另外一支,分为3个平行进化的分支。

海南产花鳗鲡细胞色素b基因的克隆及序列分析

线粒体细胞色素b基因是目前研究鱼类分子系统进化的重要分子标记.笔者以日本鳗鲡线粒体基因组序列为模板设计并合成引物进行PCR扩增,并将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和纯化后,克隆到pMD18-T载体、测序,成功得到全长为1 140 bp的海南产花鳗鲡细胞色素b(Cyt b)基因序列.将该基因全长序列递交到Genebank数据库,获得序列登录号为EF690363.用DNA分析软件MEGA2比较了海南产花鳗鲡与递交到GenBank中的8种分布在中国东南沿海、日本海域及南太平洋海域的鳗鲡属(Anguillia)细胞色素b基因的地理差异,并构建了系统进化树.结果显示:日本产和夏威夷产花鳗的地理差异小于海南产花鳗与它们之间的地理差异.

FOC4的2个过氧化氢酶基因的克隆与表达分析及其引起的香蕉苗活性氧迸发研究

为探讨香蕉枯萎病菌与寄主互作过程中过氧化氢酶的作用,分别利用硫酸钛法和羟胺氧化法测定了尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(FOC4)侵染香蕉苗根部后H2O2及超氧阴离子(O2-.)的含量变化;同时,借助GenBank中香蕉枯萎病病原菌Fo5176菌株基因组信息,采用RT-PCR方法克隆获得了FOC4的2个过氧化氢酶基因cDNA序列并对其进行了生物信息学分析以及在外源H2O2和普通巴西蕉苗诱导下的不同阶段表达模式分析。结果表明,FOC4的侵染能引起香蕉苗根部H2O2及超氧阴离子的含量增加,香蕉苗根部存在活性氧迸发;2个过氧化氢酶中,一个为孢子特异的过氧化氢酶,另一个为细胞质特异的过氧化氢酶;在香蕉苗及外源H2O2诱导下,2个过氧化氢酶表达均有上调,其中Foc4CatalaseA可能是消除强氧化胁迫环境起主要作用的过氧化氢酶之一。

心脏钠通道疾病

自从心脏钠离子通道 基因 (SC N 5A )突变 被首次鉴定 以来,人们对 SC N 5A 突变进行 了一系列研 究.SC N 5A突 变是在 两种明 显不同但 都与突 发性死 亡相关 联的疾病 ———长 Q T 波综合 症 (LQ T3)的 一种形 式和 B rugada 综合症 中被 鉴定的.后来 ,Lev-Lenegre 综 合症 进行 性的 心脏传 导缺 陷)也增 加到 LQ T3中.基因型 和表 型相 互关 系的 (研 究以及体外 表达研究提 供证据认为 SC N 5A 蛋白的结构 和功能相互 关系远比最 初预期的复 杂.心脏钠通 道的生物 物理特征与不同 的表型相关, 基因型和表型 相互关系的研究 使我们注意到 即使是单个 氨基酸的置换 都可能显而 易见的影响心脏 的兴奋性 .由 隐藏有 SC N 5A 突变的病 人提供的证 据以及临床呈 现 “重叠”现象的证 据显示已经 需要对上述提及 的疾病的传统 分类进行修改 .现在认为 钠通道综合症”作 为唯一的临 床称谓表示这 类疾病可 “能 的表型范围更合 适 .

基于COⅠ序列的DNA条形码在中国南海裸胸鳝属鱼类中的应用

为探讨中国南海裸胸鳝属(Gymnothorax)鱼类系统发育关系,采用DNA条形码技术测定了6种中国南海裸胸鳝的线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因部分序列(504bp)。结合来自GenBank中的分布于日本和3种同样分布于中国南海的裸胸鳝属鱼类的相应同源序列进行比较分析,用邻接法和最大简约法构建分子系统树。结果表明:(1)504个位点中共有187个核苷酸位点存在变异(37.1%);(2)序列变异的转换/颠换比值平均为1.5;(3)细斑裸胸鳝(Gymnothorax fimbriatus)与黑斑裸胸鳝(G.favagineus)之间的同源序列碱基差异只有0.20%,支持二者是同种异名的观点;(4)在NJ树和MP树中,蠕纹裸胸鳝和网纹裸胸鳝聚为一支,位于系统树的基部位置。其余8种聚为另外一支,然后又细分为2个较小的分支。

建立心脏功能研究的计算机模型

用计算机模拟建立生物学模型在现代生物学研究中是一种非常重要的方法.就心脏而言,从基因到细胞到整个器官,现在都建立了大量的计算机模型.这些模型在帮助我们证实心脏功能机制的假说、预测和评估药物的作用以及诊断疾病等方面都起着重要作用.就心脏不同层面的计算机模型进行了简要的综述.

人SVOP基因的cDNA克隆及表达

SV2和SVOP都是大鼠中包含有12个跨膜结构域的突触小泡蛋白.笔者从人类大脑的cDNA文库中分离得到了一个类似于大鼠突触小泡蛋白SV2和SVOP的人类新基因的全长cDNA序列,它包含一个含有1 646个核苷酸的开放阅读框,编码一个含548个氨基酸的蛋白质.生物信息学分析表明:该基因定位在第12号染色体的12q24.12区域.Northern杂交结果表明:该基因只在人类大脑组织中表达,且与无脊椎动物线虫、疟蚊和果蝇的同源基因有50%的氨基酸同源性,与脊椎动物大鼠和小鼠的同源基因有90%以上的氨基酸同源性.

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的磷酸化应激诱导蛋白1(FoSTIP1)基因的克隆及表达分析

本研究克隆了尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Fusariumoxysporumf.sp.cubenserace4,Foc4)转录因子FoS kn7一个候选的下游基因,结果表明该基因cDNA编码序列全长1737 nt,编码一个含578个氨基酸残基的蛋白质。对其编码的蛋白进行了结构域和进化分析,结果表明该蛋白质含有胁迫诱导蛋白(stress-in-ducible protein-1, STI1)结构域和多个三角形4肽重复序列结构域(tetratricopeptiderepeat,TPR)。该蛋白质与尖孢镰刀菌番茄专化型的磷酸化应激诱导蛋白1(STIP1)亲缘关系最近,因此初步将其确定为Foc4的磷酸化应激诱导蛋白并命名为FoS TIP1。采用相对荧光定量PCR方法分析了该基因在野生型B2菌株入侵香蕉苗根部及在外源H_2O_2诱导情况下的表达变化,也分析了FoSKN7基因缺失突变体中该基因在外源H_2O_2诱导情况下的表达。结果表明在入侵香蕉苗根部及在外源H_2O_2诱导情况下,B2菌株中的FoSTIP1表达均有上调,而FoSKN7基因缺失突变体中FoSTIP1即使有H_2O_2诱导,其表达也远低于B2菌株中的FoSTIP1。推测FoSTIP1可能是FoS kn7的靶基因并参与了Foc4抗外源氧化胁迫。

人类锌指蛋白新基因ZNF641的克隆及表达

从人类心脏cDNA文库中分离并鉴定了一个新的人类锌指基因ZNF641,该基因的cDNA序列全长4.9 kb,编码一个含438个氨基酸的蛋白质,从进化上看,该蛋白质在从小鼠到人的脊椎动物中都高度保守.Northern Blot分析显示:ZNF641在人类的多数组织中都有表达,尤其是在骨骼肌中有较高水平的表达.而亚细胞定位则显示ZNF641在细胞核及细胞质中均有定位.

人类多囊肾病相关蛋白TMEM130基因的克隆及生物信息学分析

以递交到GenBank上的TMEM130蛋白基因序列(nm-152913)为模板设计引物,以人大脑cDNA文库为模板进行巢氏PCR扩增,并将PCR产物克隆到pMD18-T载体上,成功获得TMEM130蛋白基因编码序列,测序结果显示,获得的序列为TMEM130蛋白基因转录变异体2,其编码序列长1272bp。该基因定位在人类第7条染色体7q22.1区域,有3个转录变异体。生物信息学分析显示该序列可编码1个含423个氨基酸的蛋白质;Smartmode程序显示该蛋白质是1个跨膜蛋白,在100～250号氨基酸序列之间有1个与多囊肾病(PKD)相关的结构域。因此,鉴定TMEM130蛋白是一个与人类多囊肾病相关的蛋白。

基于Cyt b基因序列研究6种裸胸鳝属鱼类的进化关系

为探讨中国南海裸胸鳝属(Gymnothorax)鱼类系统发育关系,采用PCR扩增产物克隆到T载体后进行序列测定,获得黄边裸胸鳝(Gymnothorax flavimarginatus)、斑点裸胸鳝(G.meleagris)、波纹裸胸鳝(G.undulatus)、云纹裸胸鳝(G.chilospilus)、匀斑裸胸鳝(G.reevesi)5种裸胸鳝的线粒体细胞色素b(cytochrome b,Cyt b)基因全序列1140bp。结合GenBank中的蠕纹裸胸鳝(G.kidako)Cyt b同源序列进行比较分析,结果表明:(1)1140个位点中共有367个核苷酸位点存在变异(32.2%);(2)序列变异的转换/颠换比值平均为3.223;云纹裸胸鳝和斑点裸胸鳝遗传距离差异最大,为0.226;(3)以花鳗鲡(Anguilla marmorata)为外群,采用NJ法和MP法构建系统发育树,在所分析的6种裸胸鳝属鱼类中,斑点裸胸鳝和波纹裸胸鳝聚为一支,位于系统树的基部位置,其余4种聚为另外一支。蠕纹裸胸鳝样本来源于日本海,其余5种裸胸鳝来源于中国南海,从系统树上来看,它们之间并没有明显的地域差异。

波纹唇鱼染色体核型分析

为了解波纹唇鱼(Cheilinus undulates)的细胞生物学特征,采用植物血凝集素PHA、秋水仙素腹腔注射和空气干燥制片法以头肾组织为材料,对波纹唇鱼的染色体核型进行了研究。结果表明,波纹唇鱼具有染色体48条,核型公式为2n=48=6m+42t,NF=54,未发现随体、次溢痕及性染色体,其核型符合典型的高位类群鱼类核型特征。

云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢及其杂交子一代间的遗传关系

应用RAPD技术研究云斑尖塘鳢、线纹尖塘鳢及其杂交子一代(F1)间的遗传关系。筛选得到25个随机引物均在亲本和杂交子一代间呈现多态,遗传相似性指数和遗传距离的计算结果显示,正交F1(云斑尖塘鳢♂×线纹尖塘鳢♀)与母本平均遗传相似系数(0.7090)高于与父本平均遗传相似系数(0.5948);反交F1(云斑尖塘鳢♀×线纹尖塘鳢♂)与母本平均遗传相似系数(0.6301)也高于与父本平均遗传相似系数(0.6089)。说明正反交子代在遗传关系上均偏向各自的母本,对扩增带和聚类图的分析均得到这一结果,表明F1所接受的双亲遗传物质并非完全对等的,所获得的遗传信息可能更多来自母本。

波纹唇鱼微卫星分子标记的筛选及适用性分析

采用磁珠富集法及利用生物素标记的（CA）15寡核苷酸探针从波纹唇鱼（Cheilinusundulatus）基因组DNABspl43I酶切位点的400～1000bp片段中筛选CA／GT微卫星位点。洗脱的杂交片段克隆到PMD18．T载体上构建富集微卫星基因组丈库后，通过PCR筛选出阳性克隆进行测序。在120条序列中有88条序列包含有重复次数不少于5次的微卫星位点，阳性序列比例达到73．33％。其中完美型（perfect）类型微卫星最多的重复次数为26次。在88条非冗长序列中，共有28条r31．82％）微卫星重复序列两端有侧翼序列能够进行引物设计。用波纹唇鱼3个个体的混合基因进行引物筛选，其中的24对具有清晰的扩增条带。将筛选的24对引物对波纹唇鱼1个群体的39个个体进行遗传多样性分析，其中4对引物扩增产物为单态，20对扩增产物呈多态性；20对扩增多态的引物在39个个体中扩增出等位基因数为2～12，平均有效等位基因数为3．5。该波纹唇鱼群体的P／C、Ho，He的平均值分别为0．0782、0．8513、0．5667。这20个微卫星位点适于波纹唇鱼群体遗传结构的研究分析。

波纹唇鱼mtDNA D-loop序列变异分析

为研究波纹唇鱼(Cheilinus undulatus)线粒体D-loop序列遗传多样性,作者采用聚合酶链式反应和克隆技术对海波纹唇鱼群体(n=25)的mtDNA D-loop序列进行克隆和测序,获得长度大约为1 400 bp的产物。用ClustalX软件进行排序比较,将结果导入MEGA5.0,结果显示出在这25尾个体中,共检测出66个变异位点,包括0个碱基缺失,4个碱基插入,59转换位点,2颠换位点及1个转换和颠换同时存在的位点。并用MEGA5.0软件构建该群25尾个体的NJ和UPGMA系统树。由DNASP软件计算出该波纹唇鱼群体的多态位点数(S)为62,核苷酸多样性(Pi)为0.00606,平均核苷酸差异数为6.907。结果表明波纹唇鱼群体的mtDNA-loop基因个体差异程度不明显。

中国裸胸鳝属10种鱼类分子系统发育关系的16S rDNA分析

为了阐明南中国海裸胸鳝属(Gymnothorax)鱼类系统进化情况,利用聚合酶链式反应扩增目的产物,将其连接到T载体后,并对其序列进行测定,共得到9种裸胸鳝属鱼类线粒体16S ribosomalDNA(16S rDNA)基因的部分序列,采用多个生物软件对序列变异和碱基组成进行分析,计算了Kimura2-parameter遗传距离,转换/颠换比等遗传信息指数,下载基因库中16S rDNA基因的同源序列,以鳗鲡属(Anguilla)的花鳗鲡(Anguilla marmorata)为外群构建NJ(Neighbore-Joining)、MP(MaximumParsimony)和ME(Minimum Evolution)系统进化树。根据所得分子数据并结合形态学特征推论如下:(1)在所研究的10种裸胸鳝鱼中共有516个位点、其中143个核苷酸位点存在变异(27.7%);(2)序列变异的转换/颠换比值的平均值为3.441;相对遗传距离数据表明斑颈裸胸鳝(G.margaritophorus)和网纹裸胸鳝(G.reticularis)差异最大(0.177),褐祼胸鳝(G.hepaticus)与布雷顿氏裸胸鳝(G.breedeni)差异最小(0.022);(3)NJ树、ME树表明裸胸鳝属内部存在3个平行进化的姐妹分支,分支内部的种类组成与地理分布无关。

4种裸胸鳝的分子遗传多样性和亲缘关系的RAPD分析

采用29个随机引物,对海南近海及西沙的野生群体黄边裸胸鳝(Gymnothorax flavimarginatus)、云纹裸胸鳝(Gym-nothorax chilospilus)、波纹裸胸鳝(Gymnothorax undulatus)及细斑裸胸鳝(Gymnothorax fimbriatus)的基因组DNA进行了RAPD分析,并用UPGMA法对这4种裸胸鳝进行聚类分析。研究结果表明:(1)黄边裸胸鳝、云纹裸胸鳝、波纹裸胸鳝及细斑裸胸鳝4种裸胸鳝群体内遗传多样性都较高,其多态位点比率分别为68.65%、57.00%、50.80%、67.42%,平均杂合度分别为0.222 1%、0.207 4%、0.166 6%、0.221 2%,表明南海野生裸胸鳝遗传变异水平较高,种质资源状况良好;(2)4种裸胸鳝种间遗传距离及聚类分析表明,黄边裸胸鳝与细斑裸胸鳝遗传距离最近(0.340 6);黄边裸胸鳝与云纹裸胸鳝的次之(0.386 8);云纹裸胸鳝与波纹裸胸鳝的最远(0.531 2)。(3)在7个引物中,有区分云纹裸胸鳝、波纹裸胸鳝及细斑裸胸鳝的特异性片段,可用于这些裸胸鳝的鉴定。

花鳗鲡脑cDNA文库的构建及GnRH基因克隆与表达分析

以花鳗鲡脑组织为材料,提取总RNA,应用CloneminerTM文库构建试剂盒构建cDNA文库。经检测,文库的滴度为4.3×106cfu/mL,总容量为5.16×107cfu/mL,阳性克隆率为99.6%,插入片段0.43—3.2kb之间,平均插入片段大小为1532bp。以文库为模板,克隆获得花鳗鲡两种类型的促性腺激素释放激素(mGnRH和cGnRH-II)cDNA序列。序列分析表明,花鳗鲡mGnRHcDNA开放阅读框(ORF)包含276个碱基,编码91个氨基酸,其中包括22个氨基酸的蛋白质前体信号肽(1—22位氨基酸)、mGnRH十肽(23—32位氨基酸)、一个三肽裂解位点(33—35位氨基酸)和56个氨基酸的GnRH相关肽(36—91位氨基酸);花鳗鲡cGnRH-IIcDNA开放阅读框包含264个碱基,编码87个氨基酸,其中包括24个氨基酸的蛋白质前体信号肽(1—24位氨基酸)、cGnRH-II十肽(25—34位氨基酸)、一个三肽裂解位点(34—36位氨基酸)和50个氨基酸的GnRH相关肽(37—87位氨基酸)。序列同源性分析表明,花鳗鲡mGnRH、cGnRH-IIcDNA与日本鳗鲡之间的相似性率高达98%;与鲑形目、鲈形目、鲽形目鱼类的相似率为73%—78%;而与鲤形目鱼类的相似性相对较低(63%—67%)。采用RT-PCR方法分析了两种GnRH基因在花鳗鲡雌雄个体中的表达,结果表明两基因在雌雄个体的组织表达模式无明显差异;但mGnRH基因在雌雄个体内表达部位多于cGnRH-II的。