鲫鱼致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及生物学特性分析

为了分离并鉴定吉林省松原市查干湖地区引起鲫鱼多种脏器出血导致死亡的病原菌,试验从患病鲫鱼的鳃及脏器中进行病原菌的分离纯化,对分离的病原菌进行形态观察、生化特性鉴定、16S rDNA和管家基因gyrB PCR扩增及序列鉴定、动物回归试验(锦鲫鱼和斑马鱼)、半数致死量(LD50)的测定、毒力基因的检测、生物学特性的检测及药敏试验。结果表明:从患病鲫鱼脾脏中分离纯化得到一株优势菌株,命名为PC-1,根据生化特性初步判断该菌株为维氏气单胞菌。分离菌株PC-1的16S rDNA基因与管家基因gyrB经PCR扩增后,分别得到大小约为1470 bp和1022 bp的目的条带,目的条带测序后分别与GenBank中已公布的序列进行BLAST比对分析,发现与其他维氏气单胞菌的核苷酸相似性在99%以上。构建的进化树显示分离菌株PC-1与其他维氏气单胞菌菌株处于同一分支。健康锦鲫鱼感染PC-1后的临床症状与自然发病鲫鱼相似,经计算,锦鲫鱼的LD50为2.0×10^(5)cfu/mL,斑马鱼的LD50为3.2×10^(4)cfu/mL。该菌携带Ⅳ型菌毛(tapA)基因、气溶素(aer)基因、细胞毒性肠毒素(act)基因、细胞兴奋性肠毒素(alt)基因、极性鞭毛(fla)基因、核酶(exu)基因、丝氨酸蛋白酶(ser)基因、弹性蛋白酶(ahyB)基因、酯酶(lip)基因9种毒力基因,不携带热稳定肠毒素(ast)基因。分离菌株PC-1培养24 h后形成较为稳定的生物被膜且生物被膜形成能力最强,同时OD600值在1.8以上。分离菌株PC-1对红霉素、羧苄西林和氨苄西林3种抗生素耐药,对米诺环素、庆大霉素和头孢氨苄3种抗生素中度敏感,对多西环素、四环素、新霉素等13种抗生素敏感。说明吉林省松原市查干湖地区鲫鱼感染的病原菌为维氏气单胞菌,该菌对鲫鱼具有较强的致病性。