双歧杆菌及灵芝孢子对胃肠菌群失调的预防

目的:探讨双歧杆菌、赤灵芝孢子及其联合制剂对小鼠胃肠菌群失调的预防作用,为临床用药提供实验依据。方法:用不同剂量双歧杆菌、灵芝孢子粉及其联合制剂灌胃7d,然后林可霉素连续灌胃7d,计数直肠成型粪便菌落。结果:(1)各预防组需氧及厌氧菌落数均明显高于菌群失调组(P<0.01);(2)双歧高剂量组需氧菌落数较正常对照组差异无显著性(P>0.05);(3)灵芝孢子高剂量组厌氧菌落数较正常对照组差异无显著性(P>0.05);中、低剂量组需氧菌落数较正常对照组差异无显著性(P>0.05);(4)联合制剂高剂量组厌氧菌落数较正常对照组差异无显著性(P>0.05)。结论:双歧杆菌、赤灵芝孢子、联合制剂有一定预防菌群失调作用。

红景天对皮肤创伤治疗的作用及机制

目的:探讨红景天促进皮肤创伤愈合的作用及机制。方法:将培养获得的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分为含药血清高、中、低剂量组,正常血清高、中、低剂量组,采用Brd U掺入法检测HUVEC细胞增殖;40只BALB/c小鼠采用打孔法制作背部皮肤损伤模型,将小鼠随机分为红景天高、中、低剂量组及正常对照组,分别给予高、中、低剂量红景天混悬液及0.5%羧甲基纤维素灌胃,于创伤第3、5、7、9、11及13天测量背部创伤面积,计算愈合率;第13天取皮肤组织做病理切片观察组织愈合情况。结果:4%含药血清对HUVEC的增殖促进作用显著高于同浓度正常血清(P<0.05);红景天灌胃高、中、低剂量组小鼠创面面积与对照组比较明显减小;第7天、9天、11天及13天红景天高、中、低剂量组小鼠创面愈合率高于对照组(P<0.05);组织学检查发现毛细血管及胶原增生与红景天灌胃呈一定剂量依赖关系。结论:红景天可以显著促进皮肤创伤的修复,机制与其促进血管内皮细胞增殖,促使血管新生,改善创伤部位新生肉芽组织血供有关。

登革2型病毒体外诱导Ana-1巨噬细胞极化及其TLR7表达的研究

目的:研究登革2型病毒体外诱导Ana-1细胞极化及TLR7表达情况,分析其在登革病毒致病过程中的可能作用。方法:用DEN2感染Ana-1细胞,24、72、120小时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测病毒核酸、iNOS、Arg-1、IL-10、IL-12p40 mRNA;Western blot检测iNOS、Arg-1、TLR7蛋白;双抗体夹心ELISA法检测TNF-α水平。结果:巨噬细胞被DEN2感染后病毒核酸在72小时达峰值,2-ΔΔCt值为159.98±37.80;iNOS mRNA及蛋白表达明显上升(P<0.05),IL-12p40 mRNA、TNF-α水平显著升高(P<0.05),72小时达峰值;IL-12p40 mRNA 2-ΔΔCt值为11.1±2.41,TNF-α浓度为(454.72±13.41)pg/ml。Arg-1 mRNA及蛋白较M2型极化对照组降低(P<0.05);IL-10 mRNA与正常对照组无显著差异(P<0.05);TLR7表达低于同期正常对照组。结论:Ana-1细胞被DEN2感染后向M1型极化;DEN2可下调Ana-1细胞TLR7表达,可能是DEN2发生免疫逃逸的机制之一;Ana-1细胞TNF-α水平与细胞内DEN2核酸呈正相关。

过表达NHE1通过上调钙蛋白酶活性降低RAW264.7细胞ABCA1蛋白表达

目的探讨过表达钠氢交换体1(NHE1)对RAW264.7细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)蛋白表达的影响。方法采用Ad NHE1腺病毒感染RAW264.7细胞,Western blot法检测NHE1-EGFP融合蛋白的表达,激光共聚焦显微镜技术检测NHE1-EGFP融合蛋白细胞内定位,酸负载p H回复检测NHE1活性,Western blot法检测NHE1-EGFP融合蛋白对RAW264.7细胞ABCA1蛋白水平及钙蛋白酶(calpain)活性的影响,加入calpain抑制剂N-乙酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-正亮氨酸(ALLN),Western blot法检测肝脏X受体激动剂TO-901317诱导ABCA1蛋白表达水平的影响。结果 Ad NHE1腺病毒感染RAW264.7细胞后,高表达NHE1-EGFP融合蛋白,定位在细胞质及细胞膜。NHE1-EGFP融合蛋白可降低ABCA1蛋白的表达水平并提高calpain活性,而calpain抑制剂ALLN能阻断ABCA1蛋白表达水平降低。结论 NHE1过表达通过上调calpain活性而降低ABCA1蛋白表达水平。

灵芝孢子粉和双歧杆菌对小鼠菌群失调的治疗作用

目的:研究灵芝孢子粉(GSP)、双歧杆菌(BB)对小白鼠肠道菌群失调的治疗作用。方法:用盐酸林可霉素注射液给实验小鼠灌胃0.36 g/kg连续6 d,建立小鼠菌群失调模型。将小鼠随机分成11组,每组10只,包括一个正常对照组(CG),一个菌群失调模型组(MIG)和9个治疗组(根据不同剂量和治疗方法建立的3个GSP治疗组,3个BB治疗组以及3个共同治疗组)。连续6 d后,处死小鼠,取直肠粪便并用生理盐水稀释成1×10-7、1×10-8、1×10-9三个稀释度,行有氧及厌氧培养48 h后作菌落计数,数据进行统计学处理。结果:成功建立了小鼠肠道菌群失调模型,MIG组的需氧菌和厌氧菌菌落计数均低于CG组,并且在经过GSP和BB治疗后小鼠肠道菌群数量明显得到恢复,其中高剂量灵芝孢子粉和高剂量双歧杆菌治疗组的效果最好,与CG组及相应中、低剂量组比较有统计学意义(P<0.05)。结论:GSP和BB对治疗因抗生素引起的肠道菌群失调有显著的作用。

胎盘多肽注射液对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的:研究胎盘多肽注射液对人脐静脉内皮细胞(ECV-304)增殖的影响。方法:采用细胞计数和MTT法观察不同稀释度胎盘多肽作用72 h后,ECV-304细胞增殖情况。同时以免疫组织化学法检测不同稀释度胎盘多肽对ECV-304细胞增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。结果:一定稀释度的胎盘多肽可促进ECV-304细胞的增殖,25 ml/L即可发挥作用,200 ml/L作用最明显。ECV-304细胞PCNA表达阳性率与胎盘多肽稀释度呈剂量相关性。结论:胎盘多肽可促进体外培养的ECV-304细胞增殖。

UC活动期及恢复期差异基因的生物信息学分析

目的对UC活动期及恢复期的差异基因进行生物信息学分析,探讨影响UC发生和发展的可能机制。方法从GEO数据库下载正常人及UC患者活动期及恢复期结直肠黏膜基因芯片数据,进行差异基因筛选、基因本体论和DEGs富集分析、构建PPI网络及解析核心关键基因。结果交叉分析显示,在UC活动期表达上调而恢复期表达下调的基因有202个;GO分析发现,差异基因在炎症反应、趋化因子介导的信号通路以及白细胞迁移等生物过程中显著富集;KEGG分析显示,差异基因显著富集在补体和凝血级联反应途径、趋化因子信号通路途径、细胞因子—细胞因子受体相互作用途径、Toll样受体信号通路等;通过Cytoscape构建PPI网络,利用cytohubba中的三种算法筛选解析到CCL2等10个核心关键基因。结论本研究初步揭示了影响UC进展的关键基因和信号通路,加深了我们对UC发生和发展的分子机制的认识,其中解析到的核心关键基因有望成为溃疡性结肠炎诊断和治疗的分子靶标。

体外扩增的NK细胞运载溶瘤呼肠孤病毒对结直肠癌细胞的杀伤效应

目的:评价体外扩增的人NK细胞能否作为呼肠孤病毒的运载细胞并探讨其临床转化应用价值。方法:体外扩增人NK细胞,用NK细胞装载呼肠孤病毒,激光共聚焦显微镜观察呼肠孤病毒与NK细胞结合的部位。NK细胞运载呼肠孤病毒(Reo-NK)到达肿瘤细胞后,CCK-8法检测在中和抗体的存在下病毒发挥的溶瘤作用;qPCR法检测肿瘤细胞内病毒RNA的相对表达量。CCK-8法检测Reo-NK对结直肠癌KRAS基因突变型(DLD-1)和野生型(CaCo-2、HT29)细胞株的杀伤效应,ELISA双抗体夹心法检测NK细胞释放的穿孔素水平。结果:呼肠孤病毒主要结合于NK细胞膜上,在人AB型血清的存在下体外扩增的NK细胞可将呼肠孤病毒传递到肿瘤细胞,且传递后的呼肠孤病毒仍具有显著溶瘤活性(P<0.01);同时检测到肿瘤细胞内病毒RNA的表达量显著增高(P<0.01)。与NK组相比,Reo-NK组对KRAS基因突变型和野生型结直肠癌细胞株的细胞毒作用均显著增强(P<0.05),穿孔素的释放均明显增加(P<0.05)。结论:体外扩增的人NK细胞适合作为呼肠孤病毒的运载细胞,且呼肠孤病毒能够增强NK细胞的细胞毒作用,两者联合后对结直肠癌细胞可发挥更强的杀伤作用,因而具有重要的临床转化应用价值。

重组HMGB1对DEN2感染Ana-1细胞分泌TNF-α及NO的影响

目的:观察不同浓度重组高迁移率族蛋白1(recombination high mobility group box protein 1,r HMGB1)对DEN2感染鼠源单核巨噬细胞Ana-1分泌TNF-α、NO及DEN复制的影响。方法:直接免疫荧光法鉴定DEN2吸附Ana-1细胞;qRTPCR检测不同时间胞内病毒载量变化;双抗体夹心ELISA法检测感染不同时间TNF-α的分泌水平,Griess试剂检测细胞释放NO变化。结果:不同剂量r HMGB1处理Ana-1细胞后,对DEN2感染细胞的病毒抑制率(%)分别为41.53±2.12﹑55.30±1.59﹑74.75±1.12﹑86.35±1.42,差异有统计学意义(P<0.05)。r HMGB1处理后,感染细胞分泌TNF-α和NO水平均有所下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:r HMGB1可有效调节DEN2感染Ana-1细胞的TNF-α和NO分泌,并抑制DEN2的增殖。

CIK细胞联合西妥昔单抗对结直肠癌细胞的杀伤效应

目的:探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)联合西妥昔单抗对KRAS突变(DLD-1)及野生型(Caco-2)结直肠癌细胞的杀伤效应。方法:采用Ficoll密度梯度离心法分离正常外周血的单个核细胞(PBMC),在体外经抗-CD3单抗及多种细胞因子联合诱导生成CIK细胞;ELISA实验检测CIK细胞培养前后上清中干扰素-γ(IFN-γ)及转化生长因子-β(TGF-β)的水平,流式细胞检测DLD-1及Caco-2细胞表面表皮生长因子受体(EGFR)及CIK细胞表面分子的表达,采用实时无标记细胞分析仪(RTCA)检查CIK细胞联合西妥昔单抗对DLD-1及Caco-2细胞的杀伤作用。结果:DLD-1及Caco-2肿瘤细胞表面均高表达EGFR,培养前后CIK细胞亚群可见培养后CD8^+T、CD3^+CD56^+NKT及CD16^+CD56^+NK细胞比例均较培养前显著增高;与培养第一天比较,培养至第14天,CIK细胞培养基上清中细胞因子IFN-γ水平显著增高(P<0.01),而同时TGF-β的水平显著降低(P<0.01);RTCA检测发现CIK细胞联合西妥昔单抗对DLD-1及Caco-2杀伤作用明显高于单一的CIK细胞组。结论:CIK联合西妥昔单抗对EGFR受体阳性的野生型结直肠癌细胞与突变型结直肠癌细胞均有杀伤效果。

还原型谷胱甘肽靶向氧化应激对肝癌干细胞的作用

目的探讨还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)干细胞性的作用。方法采用总谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(T-GSH/GSSG)测试盒检测细胞内T-GSH/GSSG水平;应用CCK-8实验评估细胞活力及干细胞培养基培养干细胞球(HCC sphere);运用流式细胞技术分析CD133阳性细胞亚群比例。结果HCC细胞中内源性T-GSH/GSSG水平比正常细胞显著升高。外源性补充GSH减少胞内活性氧物质(reactive oxygen species,ROS)并抑制HCC细胞活力及HCC sphere形成。进一步分析发现GSH显著降低CD133+肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSC)的亚群比例。结论HCC细胞中ROS水平及抗氧化防御能力增强。外源性GSH能够降低胞内的ROS水平,并抑制HCC细胞活力及干细胞性,降低LCSC在HCC细胞中的亚群比例。为靶向异常氧化应激(oxidative stress,OS)及肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)治疗HCC提供了新靶点。

RTCA技术检测NK细胞联合西妥昔单抗对结直肠癌细胞的杀伤效应

目的:利用实时无标记细胞分析技术(RTCA)检测NK细胞介导的抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)作用。方法:采用Ficoll密度梯度离心法分离正常外周血的单个核细胞(PBMC),PBMC在体外经K562工程细胞及细胞因子诱导活化扩增为NK细胞(14 d),采用流式细胞仪检测NK细胞表面分子及分析其纯度,采用RTCA技术及乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测NK细胞毒作用,RTCA检测NK细胞联合西妥昔单抗对结直肠癌细胞株杀伤作用。结果:流式细胞结果显示,经过14 d体外扩增培养后NK细胞的纯度可达86.2%;NK细胞毒作用结果显示,随着效靶比的增加(1∶1、5∶1、10∶1),LDH和RTCA检测NK细胞的杀伤作用趋势基本一致;RTCA结果显示NK细胞联合西妥昔单抗对结直肠癌细胞株杀伤作用明显高于单一的NK细胞组。结论:RTCA技术为检测NK细胞介导的ADCC作用提供了一种简便、动态及灵敏的新方法。

风险管理视角下的会计师事务所内部控制

会计师事务所是我国经济建设过程中的重要监督机构之一,是保障市场经济公平性和竞争性的重要力量,会计师事务所行业的发展得到国家的高度重视和关注。国家于2009年颁布了《关于加快发展我国注册会计师行业的若干意见》等文件,显示了国家支持会计师事务所发展的决心,在这样的时代背景下,会计师事务所迎来了历史性的发展机遇。但是较多会计师事务所由于实力不强,人员不多,规模不大等因素导致其风险承受能力较差,在市场经济中面临的风险较多,因此,会计师事务所要想获得进一步的发展,首先就要提高其风险承受能力,做好内部控制工作,并在风险管理的基础上积极开展有效的内部控制管理工作,通过内部控制工作将会计师事务所面临的风险控制在可控范围之内。本文将对会计师事务所的特点进行阐述,并分析内部控制工作和风险管理之间的关系,进一步将研究风险管理视角下的会计师事务所内部控制工作的现状和改进措施,以期给会计师事务所的发展提供一点启示和建议。

TLR3激动剂对体外NK细胞抗肿瘤活性的影响及机制

目的 探讨TLR3激动剂Poly(I∶C)转染对体外扩增的人自然杀伤(NK)细胞抗肿瘤活性的影响及可能机制。方法 将体外扩增的人NK细胞分为Poly-NKelect.组[人NK细胞经电穿孔转染Poly(I∶C)]、Poly-NK组[脂质体介导的Poly(I∶C)并转染人NK细胞]以及NK组(单独NK细胞),采用CCK-8法检查3组细胞对人结直肠癌细胞株DLD-1细胞的杀伤率;根据实验结果选择Poly-NK组细胞进行后续实验,Poly-NK组细胞经TLR3/ds RNA复合物抑制剂处理(Poly-NKinhib.组)及TLR3下游的TBK1/IKKε复合物抑制剂BX795处理(PolyNK+BX组),采用CCK-8法检测这两组细胞对DLD-1细胞的杀伤率,流式细胞仪检测这两组NK细胞活化标志物CD69的表达,ELISA检测干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及穿孔素(perforin)的表达水平。结果 与NK组比较,Poly-NKelect.组和Poly-NK组对DLD-1细胞的杀伤率增加(P<0.05);与Poly-NKelect.组比较,Poly-NK组对DLD-1细胞的杀伤率更高(P<0.01),因此后续试验均采用Poly-NK组进行比较;与Poly-NK组比较,Poly-NK+BX组对DLD-1细胞的杀伤率降低(P<0.01)、CD69表达降低(P<0.05)、perforin及IFN-γ表达降低(P<0.05);与Poly-NK组相比,Poly-NKinhib.组对DLD-1细胞的杀伤率降低(P<0.05)、CD69的表达下降(P<0.05)、TNF-α及IFN-γ的表达降低(P<0.05)。结论 Poly(I∶C)可促进人NK细胞的体外抗肿瘤活性,TBK1/IKKε激酶复合体可能参与了Poly(I∶C)对人NK细胞的活化。

溶瘤呼肠孤病毒联合CD30/CD16A双特异性抗体对NK细胞介导的ADCC效应的影响

目的 探究溶瘤呼肠孤病毒(reovirus)联合CD30/CD16A双特异性抗体(Bs Abs)对自然杀伤细胞(NK)活性及抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的影响。方法 采集健康献血者肝素抗凝静脉血30 m L,分离外周血单个核细胞(PBMC),采用免疫磁珠筛选获得NK细胞,采用流式细胞术检测NK细胞纯度;溶瘤呼肠孤病毒(reovirus)预处理NK细胞(Reo-NK组),以单独NK组为对照,采用乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测2组NK细胞的活化作用;reovirus联合(CD30/CD16A) Bs Ab杀伤KARPAS-299细胞,分为Ig G1处理组(Ig G1+NK组)、CD30/CD16A处理组(CD30/CD16A+NK组)、病毒联合Ig G1处理组(Ig G1+Reo-NK组)及病毒联合CD30/CD16A处理组(CD30/CD16A+Reo-NK组),采用LDH释放实验检测各组NK细胞的活化作用,采用流式细胞术检测各组NK细胞表面活化标注物CD69和细胞毒性颗粒CD107a的表达;用reovirus联合(CD30/CD16A) Bs Ab处理NK细胞(Reo-NK+CD30/CD16A组),以NK联合(CD30/CD16A) Bs Ab为对照(NK+CD30/CD16A组),采用LDH释放试验检测2组NK细胞对Raji细胞的杀伤效应。结果 体外新鲜分离的NK细胞纯度可达70%以上;与单独NK细胞组相比,Reo-NK组DLD-1细胞的杀伤率明显增高(P<0.01);KARPAS-299细胞上CD30分子的阳性率高达90%以上;Ig G1与(CD30/CD16A) Bs Ab抗体浓度大于1.00×10^-12mol/L时,与NK+Ig G1组相比,NK+CD30/CD16A组促进KARPAS-299细胞死亡率(P<0.05);与Reo-NK相比,Reo-NK+CD30/CD16A组能明显促进KARPAS-299细胞死亡率(P<0.01);随着reovirus滴度增加,NK细胞表面活化标致物CD69及细胞毒性物质CD107a阳性率随之上升;reovirus与(CD30/CD16A) Bs Abs相比可以进一步促进NK细胞的活化。结论 Reovirus可促进NK细胞的活化并增强其细胞毒作用,联合(CD30/CD16A) Bs Abs后可进一步促进NK细胞介导的ADCC效应。

NEXN基因高表达预示结直肠癌患者的不良预后且与免疫抑制性细胞浸润相关

目的研究nexilin F-肌动蛋白结合蛋白(NEXN)基因表达与结直肠癌患者预后及免疫细胞浸润的相关性。方法利用Oncomine数据库分析NEXN基因在肿瘤和正常组织中的表达差异;通过Prognoscan数据库分析NEXN基因表达与结直肠癌患者预后的关系;通过TIMER及GEPIA数据库分析NEXN基因高表达与免疫浸润的相关性。结果 Oncomine数据库分析结果表明NEXN在结直肠癌中高表达(fold change=3.057,P<0.000 1);Prognoscan数据库GSE17536和GSE14333的芯片分析结果表明,NEXN高表达与结直肠癌患者的不良预后呈正相关(P<0.05);TIMER数据库分析显示NEXN与CD4+T细胞、巨噬细胞、树突状细胞及中性粒细胞的浸润具有中度或强的相关性(COR值>0.4,P<0.05);进一步分析不同细胞亚群标志基因发现NEXN高表达与Treg细胞、M2巨噬细胞标志基因表达呈中度或强的相关性,与T细胞耗竭相关基因TIM3和TIGIT呈中度相关性(COR值>0.4,P <0.05);利用GEPIA数据库分析也证实上述结果。结论 NEXN高表达与结直肠癌患者不良预后呈正相关,而M2型巨噬细胞、Treg细胞的浸润可能是重要的原因。

不同刚度Ⅰ型胶原凝胶三维环境调控NK细胞免疫功能

目的构建不同刚度Ⅰ型胶原凝胶并探讨其三维(three-dimensional,3D)培养环境对自然杀伤(natural killer,NK)细胞形态、自由迁移能力以及细胞杀伤功能的影响。方法分离Sprague Dawley(SD)大鼠鼠尾Ⅰ型胶原蛋白并制备不同刚度的胶原凝胶,通过激光共聚焦显微镜观察其微结构,流变仪测量平台期的储能模量表征其刚度。将NK-92MI细胞培养于不同刚度Ⅰ型胶原凝胶中,倒置显微镜观察NK-92MI细胞的形态,高内涵成像系统记录NK-92MI细胞的自由迁移过程,分析迁移速度和距离。不同刚度的Ⅰ型胶原凝胶培养NK-92MI细胞24、48 h,再与人结直肠腺癌上皮细胞(DLD-1)共培养后,用CCK8法检测DLD-1细胞增殖率,分析NK-92MI细胞的细胞杀伤能力。结果成功制备出刚度为(10.97±2.10)Pa的低刚度Ⅰ型胶原凝胶和刚度为(114.50±3.40)Pa的高刚度Ⅰ型胶原凝胶。与在低刚度Ⅰ型胶原凝胶中相比,在高刚度Ⅰ型胶原凝胶中,NK-92MI细胞呈现更细长的形态(P<0.05),细胞平均面积减少〔(69.88±26.97)μm^(2)vs.(46.59±21.62)μm^(2),P<0.05〕,细胞圆度减小(0.82±0.12 vs.0.78±0.18,P<0.05),细胞迁移速度降低〔(2.50±0.91)μm/min vs.(1.70±0.72)μm/min,P<0.001〕,迁移距离缩短〔(147.10±53.74)μm vs.(98.03±40.95)μm,P<0.0001〕,差异均有统计学意义。与低刚度Ⅰ型胶原凝胶相比,高刚度Ⅰ型胶原凝胶培养24 h的NK-92MI细胞可促进DLD-1细胞增殖〔增殖率(46.39±12.79)%vs.(65.87±4.45)%,P<0.05〕,降低细胞杀伤能力,48 h的比较结果类似〔增殖率(31.36±2.88)%vs.(74.57±2.16)%,P<0.05〕,差异均有统计学意义。结论不同刚度Ⅰ型胶原凝胶3D培养环境可改变NK-92MI细胞的形态、迁移能力以及杀伤功能。该研究为探索和理解生物力学微环境影响NK细胞免疫应答机制提供了研究基础,为优化免疫治疗方案提供理论依据。