面向21世纪医学微生物学教学内容改革的思考

高等学校教学时间的有限性和知识增长的无限性之间的矛盾越来越尖锐。要解决好这一矛盾,保证知识、能力、素质的协调发展,关键是深化教学内容改革,充分利用有限的授课时间,最大限度地提高教学效率和效果。近年来,我们对五、七年制临床医学专业医学微生物学教学内容的改革进行了一些思考和尝试。

提高医学微生物学实验课教学质量培养学生综合素质

要成为一名合格的医学生,必须具有扎实的理论功底和熟练规范的操作技能。微生物学作为一门重要的医学基础课程,是连接基础与临床的桥梁。合理高效地安排微生物实验课,有利于培养学生独立思考解决问题及动手能力。

检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7的环介导等温扩增和PCR法比较

目的建立基于环介导等温扩增(LAMP)技术的肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7快速简便检测方法,并与PCR进行比较。方法针对EHEC O157:H7保守的rfbE基因序列,设计特异性引物,建立LAMP和PCR检测技术并优化其反应条件,比较这两种检测方法的灵敏度、特异性和对实际样品的检测结果。结果成功建立了LAMP和PCR检测体系,灵敏度检测结果显示,LAMP检测限低至10 cfu/ml,PCR检测限为102cfu/ml,LAMP检测灵敏度高于PCR;对39株近源菌进行检测,结果显示,LAMP法仅7株EHEC O157:H7得到阳性结果,非EHEC O157:H7菌株均为阴性,PCR产物则出现非特异性条带,LAMP法特异性比PCR法高。对于32份猪肉样品的检测,LAMP和PCR与常规检测结果一致,3份样品检测阳性。结论 LAMP检测技术的特异性和灵敏度较PCR高,并且操作简便、检测成本低,耗时短,更有望发展成为快速准确检测EHEC O157:H7的有效手段。

SARS冠状病毒的分离培养与鉴定

采集急性期病人的咽拭子或漱口液,用Vero、Vero E6、MDCK、Hela、Hep-2等传代细胞,人胚肺二倍体细胞(HEL)和人胚肺(HP)细胞分离培养严重急性呼吸系统综合症(SARS)的病原体。结果用Vero、Vero E6、MDCK和HP细胞从标本中分离到一株病毒。间接免疫荧光试验发现,恢复期病人血清可与所分离的病毒起反应,在胞膜和胞浆中出现翠绿色荧光;中和试验结果表明,恢复期病人血清能中和病毒对细胞的致细胞病变作用:电镜下可观察到冠状病毒样颗粒:RT-PCR法可扩增到冠状病毒特异性基因片段,且其核苷酸序列与国内外发表的SARS冠状病毒(SARS-Cov)相应的基因序列相符,同源性达到100％。从传染性非典型肺炎病人的漱口液中分离到SARS冠状病毒,这种病毒与传染性非典型肺炎密切相关。

SARS冠状病毒M蛋白二级结构和B细胞抗原表位的稳定性分析

目的预测具有代表性的3株SARS冠状病毒M蛋白二级结构和B细胞抗原表位,探讨基因变异对M蛋白二级结构和B细胞抗原表位的影响。方法采用Chou-Fasman方法、Garnier-Robson方法和Karplus-Schulz方法预测SARS冠状病毒M蛋白二级结构;按Kyte-Doolittle方案、Emini方案和Jameson-Wolf方案预测B细胞抗原表位。结果3株SARS冠状病毒M蛋白的二级结构和B细胞抗原表位完全一致。结论SARS冠状病毒M蛋白的二级结构和抗原表位比较稳定,提示利用某一毒株的M蛋白制备单克隆抗体和疫苗可应用于SARS的诊断和防治。

OM-500型臭氧空气消毒杀菌机杀菌效果观察

目的:研究OM-500型臭氧空气消毒杀菌机的杀菌效果。方法:采用载体定量表面杀菌试验及现场空气消毒试验两种方法观察臭氧作用不同时间对物体表面细菌及空气中细菌的杀灭效果。结果:用载体定量表面消毒杀菌试验,对金黄色葡萄球菌杀灭率60min达94·41%;对大肠杆菌杀灭率5min达97·3%,60min达100%;用现场空气消毒试验法,空气中自然菌减少率30min可达90·88%,60min达到95·74%,120min达到99·03%。结论:本机型消毒效果良好。

幽门螺杆菌基因hp0231和hp0410的克隆表达及生物信息学分析

目的获取幽门螺杆菌hp0231和hp0410基因的序列,预测其编码蛋白HP0231和HP0410作为候选疫苗的可行性,在大肠杆菌表达系统中表达hp0231和hp0410。方法提取幽门螺杆菌标准株NCTC11639的基因组DNA,按照GenBank中幽门螺杆菌标准株22695的序列设计引物PCR,扩增hp0231和hp0410基因,克隆入pMD18-T载体中测序,进行生物信息学分析。将hp0231和hp0410克隆入表达载体pGEX-4T-1中,诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。结果生物信息学分析表明HP0231和HP0410均为外膜蛋白,具良好的抗原性,并且与其他生物的同源性较低,其作为Hp疫苗不易产生交叉反应以及自身免疫性反应,构建的重组菌可高水平表达可溶性重组蛋白。结论HP0231和HP0410是有良好应用前景的Hp候选疫苗。

SARS冠状病毒S2基因原核表达及免疫学特性

目的研究严重急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒S2蛋白表达并对其免疫学特性。方法克隆SARS冠状病毒S2基因,并在大肠埃希菌中表达谷胱甘肽硫转移酶(GST-S2)融合蛋白。通过免疫印迹(Westernblot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法鉴定表达GST-S2融合蛋白的活性。结果通过原核系统表达的GST-S2融合蛋白可与谷胱甘肽硫转移酶(GST)多克隆抗体结合,并在85千道尔顿(KD)处出现特异性结合条带。GST-S2蛋白能与SARS患者恢复期血清反应,而不与正常人血清反应。结论本项研究获得了SARS冠状病毒GST-S2融合蛋白,它可与GST多克隆抗体特异性结合,并与SARS患者恢复期血清发生特异性反应。

体外拮抗幽门螺杆菌的人嗜酸乳杆菌菌株的选育

目的 探讨人嗜酸乳杆菌对幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori,HP)毒力株的体外拮抗作用 ,筛选出对 HP毒力株有明显拮抗作用的嗜酸乳杆菌菌株。方法 从健康人胃肠道中分离出 5 2株嗜酸乳杆菌可疑株 ,通过其培养特性 ,生理特性 ,生化反应及代谢产物测定等进行鉴定 ,获得 2 6株嗜酸乳杆菌。同时 ,从临床患者胃活检标本中分离出 2 3株 HP菌株 ,用 PCR方法筛选出 cag A阳性 HP毒力株 ,然后 ,采用打孔法进行嗜酸乳杆菌培养上清拮抗 HP毒力株的实验 ,以 1%的乳酸作对照。结果 筛选出 4株对 HP毒力株有明显拮抗作用的嗜酸乳杆菌 ,这种拮抗作用不依赖嗜酸乳杆菌分泌的乳酸。结论 人嗜酸乳杆菌在体外对 HP毒力株具有明显拮抗作用。该研究为应用微生态疗法治疗 HP感染提供了理论基础。

SARS病例尸解标本和咽嗽液中病原体检测

目的 确定严重急性呼吸系统综合征(SARS)病例尸解肺组织和咽嗽液中病原体种类。方法 用超薄切片电镜技术观察广东省传染性非典型肺炎流行早期3例死亡病例尸解肺组织标本,用RT- PCR法扩增尸解肺组织和SARS病人咽嗽液中SARS冠状病毒特异核酸片段,并进行序列测定。结果 在死亡病人肺组织中观察到衣原体的网状体、中间体以及原体颗粒,并见衣原体包涵体样结构;用RT- PCR法在2例尸解肺组织扩增出预期大小的DNA片段,测序后经相似性(BLAST)比较,其与SARS冠状病毒相应基因片段高度同源;用巢式RT -PCR技术在SARS病人咽漱液中扩增出SARS冠状病毒特异基因片段。结论 在SARS尸解肺组织中发现衣原体样颗粒,在尸解肺组织和咽漱液中扩增出SARS冠状病毒核酸片段,说明SARS患者可合并衣原体等微生物混合感染。

SARS冠状病毒的起源研究进展

SARS冠状病毒(SARS—CoV)是一种新现病毒,可感染多种动物,果子狸是人类SARS—CoV重要的动物宿主之一,是已知较理想的实验动物模型。遗传因素在SARS-CoV的出现过程中起重要作用,它很可能是哺乳动物和鸟类冠状病毒之间重组产生的新物种,但发生基因重组不是SARS在人群中暴发的原因。

幽门螺杆菌napA基因的克隆及生物信息学分析

[目的]获取幽门螺杆菌NCTC 11639中性粒细胞激活蛋白基因(napA),预测其编码蛋白作为幽门螺杆菌疫苗候选抗原的可行性,为Hp疫苗研制奠定基础。[方法]提取幽门螺杆菌标准株NCTC 11639的基因组DNA,参照GeneBank中幽门螺杆菌标准株22695的序列设计引物PCR扩增napA基因,克隆入pMD18-T载体中,对重组质粒测序后进行生物信息学分析。[结果]克隆的napA基因全长为435bp,在GenBank上登录(No.DQ341279),与Gen-Bank公布的其它Hp菌株的核酸同源性为94%～98%,与国际测序模式株Hp26695、HpJ99同源性达97%。[结论]成功扩增Hp标准株NCTC 11639 napA基因,通过同源性检索分析表明Hp与人及其它哺乳动物的基因组DNA同源序列低,在不同Hp菌株中高度保守,符合疫苗候选抗原的基本特征;抗原表位预测显示有4条高抗原性肽段,其中118-140肽段抗原指数最强,可能存在良好的抗原表位,结合Hp-NAP二级结构、亲水性分析认为Hp-NAP是很有前景的幽门螺杆菌疫苗候选抗原。

运用天空教室软件平台制作病原生物学精品课程网站

运用天空教室精品课程软件建成病原生物学精品课程申报网站及课程网站,组织申报省级精品课程。介绍天空教室软件的适用性、操作方法、技术流程、制作经验及病原生物学网站建设整体思路。

幽门螺杆菌黏附素研究进展

幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，Hp）是一种定植于胃和十二指肠黏膜的革兰阴性菌．与慢性胃炎、消化道溃疡和胃癌的发生密切相关。耶感染率在世界人群中超过50％。目前针对跏的感染主要是采取三联或四联抗菌疗法。然而。随着耐药菌株的不断增多，研制安全有效的疫苗成为控制耶感染的新出路。

结核杆菌诱导的凋亡中性粒细胞对人巨噬细胞活性的影响

目的探讨结核杆菌诱导的凋亡中性粒细胞对人巨噬细胞活性的影响。方法从人外周血中分离中性粒细胞和单核细胞,用结核杆菌感染中性粒细胞诱导其凋亡,再用单核细胞来源的巨噬细胞吞噬凋亡粒细胞,培养18h后测定其细胞因子产生情况。结果吞噬结核杆菌诱导的凋亡粒细胞可促进人巨噬细胞产生致炎症细胞因子TNF-α,但不影响抗炎症细胞因子TGF-β和IL-10的产量。结论结核杆菌诱导的凋亡中性粒细胞,能增强人单核细胞来源的巨噬细胞的活性,代表一种新的宿主防御机制。

SARS冠状病毒M基因的克隆及序列分析

目的克隆SARS冠状病毒(SARS-CoV)GD322株M基因,并进行序列分析。方法根据GenBank中公布的SARS冠状病毒Tor2株M基因序列,设计一对引物,用RT-PCR法从SARS-CoVGD322株基因组中扩增M基因片段。克隆至pET-32(a)载体,转化大肠杆菌BL-21后测序,利用DNAstar和ClustalX分析所测序列翻译的氨基酸与81株SARS-CoVM基因翻译的氨基酸序列的差异。结果该M基因与Tor2株M基因核苷酸同源性为99.86%;与已收集的81株SARS-CoVM基因所译氨基酸相比,和41株(占50.62%)M蛋白完全同源,37株(占45.68%)仅有一个氨基酸改变,同源性为99.55%,仅与3株(占3.70%)有2个氨基酸差异,同源性为99.10%。结论已获得具有代表性的SARS-CoVM基因重组质粒。

SARS冠状病毒M基因在大肠杆菌中的表达及其免疫学特性初步研究

【目的】在大肠杆菌中表达SARS冠状病毒包膜(M)蛋白与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,并对其进行血清学鉴定。【方法】克隆编码SARS冠状病毒M蛋白的基因,并在原核系统中表达GST-M融合蛋白,用Westernblot和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析GST-M融合蛋白。【结果】10份SARS患者恢复期血清均能识别M-GST融合蛋白,并在Mr=52000附近出现特异性结合带;而10份正常人血清不与M-GST融合蛋白起反应。【结论】本研究获得了SARS冠状病毒GST-M融合蛋白,它可与SARS患者的恢复期血清产生特异性的结合反应,为研究SARS冠状病毒感染宿主细胞的过程和制备重组疫苗提供了条件。

幽门螺杆菌基因克隆表达及其抗原表位分析

目的克隆表达幽门螺杆菌基因hp0410,构建12肽噬菌体展示库,对hp0410的抗原表位进行筛选和分析,为构建多表位嵌合疫苗提供理论依据。方法从幽门螺杆菌NCTC11639基因组DNA中扩增出hp0410,并克隆入pGEX-4T-1中表达。利用纯化重组蛋白筛选出特异性单抗E018,利用该单抗和M13噬菌体12肽随机肽库,构建HP0410抗原表位的抗原展示库。竞争-抑制实验验证获得的阳性噬菌体并测序,生物信息学分析HP0410的抗原表位。结果成功构建可高水平分泌型表达HP0410的原核表达系统。对13株阳性噬菌体测序后获得8个表位,其中候选表位1个。HP0410可有效抑制展示该表位的噬菌体与单抗E018结合。分析表明,获得的8个表位与HP0410同源性不高,但处于生物信息学预测的区域。结论获得8个HP0410高抗原性区域的模拟表位,其中1个为模拟单抗E018特异性结合的抗原决定基的候选表位。