正常与氧糖剥夺再复氧培养的星形胶质细胞来源外泌体miRNA测序分析

本研究通过高通量测序技术,分析正常培养和氧糖剥夺再复氧(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)培养星形胶质细胞来源外泌体的差异微小RNA(microRNA,miRNA)。采用超速离心法提取正常组和OGD/R组星形胶质细胞培养基上清的外泌体,透射电镜观察到提取的外泌体呈典型囊泡状,包膜完整,含有低电子密度的物质;纳米颗粒追踪技术(NTA)检测到星形胶质细胞外泌体大小为100.5±31.1 nm,占比为96.8%;免疫印迹检测显示,提取物中有外泌体标志性蛋白肿瘤易感蛋白(tumour-susceptibility protein,TSG101)、热休克蛋白60(heat shock proteins 60,Hsp60)、ALG-2相互作用蛋白X(ALG-2-interacting protein X,ALIX)的表达。与正常组相比,OGD/R组共有41个miRNA发生显著改变,其中20个miRNA显著升高,21个miRNA显著降低(P<0.05)。基因本体功能(GO)分析显示,差异靶基因主要参与蛋白质糖基化、脂质代谢过程、磷酸化作用、高尔基体、内质网、内吞体、细胞质囊泡和细胞突起等生物学过程;京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析发现,差异靶基因主要与丁酸代谢、β-丙氨酸代谢、脂肪酸降解、线粒体自噬和P53信号通路等代谢途径和信号通路有关。通过对正常组和OGD/R组的星形胶质细胞来源的外泌体miRNA测序并进一步施行靶基因功能富集分析,为后续研究星形胶质细胞外泌体对氧糖剥夺再灌注神经元发挥的保护作用的具体机制提供了一定的研究基础。

N2a/APP695细胞表达载脂蛋白E4对线粒体自噬的影响

目的探讨载脂蛋白E4(APOE4)表达对N2a/APP695细胞中线粒体自噬的影响。方法慢病毒APOE4感染N2a/APP695细胞构建表达APOE4细胞组(表达组),同时设立N2a/APP695正常细胞组(正常组)、阴性对照慢病毒空载N2a/APP695细胞组(阴性对照组),共3个实验组;培养72 h后进行嘌呤霉素筛选处理,Western blot检测细胞APOE4表达情况、线粒体融合蛋白-2(MFN2)、MFN1及线粒体分裂蛋白-1(FIS1)、线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin及微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达,激光共聚焦观察线粒体形态及细胞中胆固醇含量,免疫荧光观察线粒体与LC3Ⅱ的共定位情况。结果成功构建表达APOE4的慢病毒感染N2a/APP695细胞;与正常组和阴性对照组相比,表达组MFN2、MFN1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),FIS1、PINK1、Parkin蛋白表达明显上调(P<0.01),LC3Ⅱ/Ⅰ比值下调(P<0.05),线粒体形态碎片化和细胞中胆固醇高,LC3Ⅱ与线粒体的共定位减少。结论表达APOE4的N2a/APP695细胞中线粒体分裂增多、线粒体自噬关键通路障碍、自噬异常,这可能与APOE4减少胆固醇外排、细胞内游离胆固醇增多、进而破坏线粒体分裂融合平衡有关。

上调C99片段对N2a/APP695细胞中MAM活性及线粒体自噬的影响

目的探讨上调淀粉样前体蛋白(APP)剪切产物C99对线粒体相关内质网膜(MAM)及线粒体自噬的影响。方法制作N2a/APP695细胞的AD模型,分为正常对照组及γ-分泌酶抑制剂组(DAPT组,10μmol/L DAPT完全培养基培养20 h);采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测2组细胞中C99、胆固醇酰基转移酶(ACAT1)、线粒体融合蛋白1和2(MFN2/1)、线粒体分裂蛋白1(FIS1)、线粒体自噬相关蛋白PTEN诱导的推定激酶1(PINK1)、E3泛素-蛋白连接酶(Parkin)、微管相关蛋白1-轻链3(LC3)、P62蛋白及细胞抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2蛋白(BCL-2)的表达;用JC-1染色法检测线粒体膜电位变化情况,激光共聚焦显微镜检测线粒体与内质网偶联情况。结果经过DAPT处理20 h后DAPT组N2a/APP695细胞中C99蛋白表达明显增加(P<0.01);与正常对照组比较,DAPT组细胞中ACAT1、MFN2、MFN1、FIS1、PINK1、Parkin及LC3蛋白表达水平上调,但P62、BCL-2蛋白表达下调,差异有统计学意义(P<0.05);JC-1染色结果显示,DAPT组细胞中线粒体膜电位较正常对照组明显降低(P<0.01),而内质网与线粒体偶联增加。结论上调C99水平可以使N2a/APP695细胞中MAM的活性增加,影响线粒体分裂融合后导致线粒体自噬异常。

SD大鼠星形胶质细胞来源外泌体的提取及鉴定

对原代培养的SD大鼠星形胶质细胞分泌的外泌体进行提取并鉴定。首先原代培养大鼠星形胶质细胞,免疫荧光鉴定星形胶质细胞标记性蛋白(胶质纤维酸性蛋白:glial fibrillary acidic protein,GFAP)以鉴定星形胶质细胞的纯度,然后采用超速离心法对大鼠原代星形胶质细胞培养上清液中的外泌体进行分离和提取;外泌体纳米微粒追踪技术检测所提取外泌体的粒径大小和浓度,透射电镜观察其形态特征,免疫印迹检测外泌体特异性标记物跨膜蛋白CD9、肿瘤易感蛋白(tumour-susceptibility protein,TSG101)、热休克蛋白70(heat shock proteins 70,Hsp70)、ALG-2相互作用蛋白X(ALG-2-interacting protein X,ALIX)蛋白的表达等方法对所提取的外泌体进行鉴定。纳米微粒追踪技术显示提取的外泌体平均大小为(107.6±44)nm,占比为99.1%,符合外泌体大小的标准,并且浓度较高;透射电镜观察到细胞培养上清液提取物中有典型呈杯托状的外泌体,其胞膜完整,含有低电子密度的物质;免疫印迹检测显示所提取物中有外泌体特异性蛋白CD9、TSG101、HSP70、ALIX的表达。实验结果表明,采用超速离心法能从大鼠原代星形胶质细胞培养上清液中提取得到高纯度的外泌体,为后续研究星形胶质细胞来源外泌体的功能提供了良好的实验基础。