靶向蛋白质泛素修饰及降解在前列腺癌治疗中的机遇与挑战

前列腺癌是中国发病率增长最快的男性肿瘤,抗雄激素治疗耐药是导致前列腺癌患者预后差的主要原因。因此,解决耐药性难题是前列腺癌转化研究的关键问题。哺乳动物细胞利用泛素-蛋白酶体系统实现蛋白质的靶向降解。因此,前列腺癌中关键的癌基因如雄激素受体(AR)的上游泛素化调控因子(如去泛素化酶)是潜在的治疗靶点。然而,这些酶具有较广的底物谱系,存在脱靶的可能性。近来,基于泛素-蛋白酶体系统开发的蛋白质降解靶向嵌合体(proteolysis-targeting chimeras,PROTAC)技术是最具前景和革命性的新型抗癌药物研发技术,能够利用特定E3泛素连接酶对靶蛋白进行降解而不影响其他底物。与传统小分子抑制剂相比,PROTAC分子在克服耐药性以及针对不可成药的靶点方面拥有巨大优势。目前,针对AR的PROTAC降解剂已在II期临床取得了成功,靶向蛋白质泛素化及降解途径的新技术将有望为前列腺癌的临床治疗带来新的突破。

丙二醛对大鼠肝线粒体呼吸功能及相关脱氢酶活性影响

目的:探索脂质氧化终产物丙二醛(MDA)在体外对线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶活性的影响。方法:采用不同浓度MDA体外干预大鼠肝线粒体,氧电极法检测线粒体呼吸控制率(RCR)、磷氧比(P/O),测定呼吸链复合物及α酮戊二酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶活性。结果:线粒体经MDA作用后,以苹果酸/谷氨酸或琥珀酸作底物,线粒体两条呼吸途径对MDA呈现不同的耐受力,前者在MDA100μmol/L时RCR显著降低(P<0.05),400μmol/L时P/O降低(P<0.05);后者MDA浓度达到400和800μmol/L时,线粒体P/O及RCR值显著降低(P<0.05)。丙酮酸脱氢酶及α酮戊二酸脱氢酶分别在50μmol/L和100μmol/L时活性下降(P<0.05),而MDA浓度达到1mmol/L时,苹果酸脱氢酶活性降低(P<0.05)。呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ分别在MDA400和800μmol/L时最大反应速度(Vm)降低(P<0.05),但MDA(0～3.2mmol/L)对呼吸链复合物Ⅲ、Ⅳ的Vm及米氏常数(Km)没有影响。结论:MDA对线粒体呼吸链及α酮戊二酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶存在不同程度的损伤作用,不同酶对MDA损伤的敏感程度有所差异,本研究中相关酶受MDA损伤的次序可能是:丙酮酸脱氢酶、α酮戊二酸脱氢酶、呼吸链复合物Ⅰ、呼吸链复合物Ⅱ、苹果酸脱氢酶、呼吸链复合物Ⅲ、Ⅳ。

基因芯片技术筛选孕期缺锌仔鼠脑中差异表达基因

目的: 探讨母鼠在孕期和哺乳期缺锌对仔鼠成年后脑功能特别是学习记忆能力的影响,考察孕期缺锌母鼠所产仔鼠脑内基因的差异表达状况并筛选相关差异表达基因。方法: 怀孕ICR雌鼠24只随机分为(A)对照组,(B)孕期及哺乳期轻度缺锌组,(C)孕期严重缺锌组。对照饲料、轻度缺锌饲料及缺锌饲料的锌含量分别为100 mg/kg、5 mg/kg和1 mg/kg。仔鼠断乳后饲喂普通市售饲料。A、B组仔鼠70日龄(P70)后以穿梭箱法测试仔鼠的学习记忆能力,并制备海马脑片检测仔鼠长时程增强(LTP)变化情况;以A组仔鼠作对照,基因芯片技术检测C组仔鼠(P1)脑中差异表达基因。结果: C组仔鼠出生后即死亡。行为测试中,B组仔鼠达到学习标准所需次数多于A组仔鼠,二者有显著性差异;B组仔鼠海马脑片诱导的LTP低于A组仔鼠;基因芯片检测初步确认C组仔鼠脑中有8条差异表达基因(A组仔鼠作对照,表达差异2倍以上),其中5条锌上调序列,3条锌下调序列。结论: 孕期及哺乳期轻度缺锌即可造成仔鼠成年后学习记忆能力下降,同时也影响海马的突触可塑性,故孕期是锌缺乏造成脑功能损伤的关键时期;孕期缺锌引发的仔鼠成年后脑功能损伤可能与神经细胞Ras-MAPK信息传递途径中MAPKK2表达紊乱有关。

小鼠ZnT3 cDNA片断的克隆及其mRNA表达

为了解ZnT3 (zinctransporter3 )mRNA在小鼠各组织中的表达状况 ,用反转录多聚酶链反应法 (RT PCR)克隆ZnT3cDNA片断 ,荧光标记的全自动测序法确定ZnT3cDNA片断的碱基顺序 ,RT PCR法检测小鼠各组织ZnT3mRNA表达并比较在组织中的表达量。结果 :RT PCR获得单一条带的片断 ,其大小 70 0bp ,碱基顺序与文献报道序列一致 ;在大脑皮层、海马和睾丸中检测到ZnT3mRNA表达 ,其中睾丸中表达量最高 ,大脑皮层、海马表达量无显著性差别 ,心、肝、脾、肺、肾、小肠及嗅球、小脑等组织中未见ZnT3mRNA表达。说明克隆到正确的ZnT3cDNA片断。ZnT3mRNA主要表达于睾丸、大脑皮层、海马 。

黄素单核苷酸对羟自由基损伤的大鼠肝线粒体复合物Ⅰ的保护作用

目的:观察黄素单核苷酸(FMN)对羟自由基(OH·)损伤线粒体酶复合物1(complexⅠ)的作用,分析FMN与complexⅠ的相互作用机制。方法:差速离心法分离大鼠肝线粒体,OH·体外损伤线粒体,氧电极法测定线粒体耗氧速率,比色法检测线粒体complexⅠ动力学参数及线粒体内MDA、GSH含量及SOD活性。结果:OH·损伤后,线粒体3态、4态(state3,state4)耗氧速率、complexⅠ最大反应速度(Vm)降低(P<0.05),但呼吸控制率(respiratorycontrolratio,RCR)、磷氧比(P/O)及complexⅠ米氏常数(Km)不变,线粒体中GSH含量下降(P<0.05),SOD活性降低(P<0.05),MDA含量升高。损伤线粒体补充FMN165ng/ml可部分恢复complexⅠ呼吸途径state3耗氧速率(P<0.05),补充FMN82.5～165ng/mg可显著提高OH·损伤的线粒体复合物Ⅰ的Vm(P<0.05)。损伤线粒体补充较低剂量的FMN(FMN<82.5ngFMN/ml),线粒体中GSH、SOD、MDA含量不发生变化,在补充较高剂量FMN(>165ngFMN/ml)时,SOD活性升高(P<0.05),但线粒体MDA含量升高(P<0.05)、GSH含量下降(P<0.05)。结论:FMN能够提高氧化损伤线粒体复合物Ⅰ活性,促进complexⅠ呼吸途径的state3耗氧速率。FMN不能直接清除OH·及自由基,可能通过保护complexⅠ中的酶结合/活性位点免受OH·等自由基攻击从而维持酶活性。

锌对断乳小鼠金属离子转运体mRNA表达的影响

目的 观察哺乳期后幼鼠在不同膳食锌水平条件下的生长情况 ;探索膳食锌对幼鼠 2价金属离子转运体 (DMT1)mRNA表达所产生的影响。方法 2 0只肿瘤研究所 (ICR)幼鼠 (P2 1)随机分为膳食缺锌 (ZD ,Zn 1mg/kg)、适锌 (ZA ,Zn 30mg/kg)、高锌 (ZS ,Zn 180mg/kg)、对喂 (PF ,Zn 180mg/kg) 4组。以相应饲料饲喂 3周 (P2 1～P4 2 ) ,观察小鼠P2 1～P4 2期间的摄食量及体重变化。饲喂 3周后 ,处死小鼠取血清及相关组织 ,原子吸收分光光度法测定小鼠血清锌含量。半定量 (RT -PCR法 )检测不同膳食锌水平幼鼠P4 2时DMT1mRNA的表达状况。结果 断乳幼鼠饲喂不同水平膳食锌 3周后 ,缺锌幼鼠摄食量及体重显著低于其余各组 ,血清锌与其余各组存在显著性差异。膳食高锌可致睾丸DMT1mRNA表达显著降低 ,约为适锌时表达量的 1/ 3～ 1/ 4 ,脑中DMT1mRNA表达未见变化。结论 哺乳期后保证膳食足量锌对幼鼠的生长发育十分重要 ;小鼠睾丸DMT1mRNA在高锌时表达量下降可能是哺乳期后幼鼠维持锌内稳态的一种反馈保护机制。

线粒体营养素

线粒体是细胞内进行三羧酸循环、脂肪酸代谢、氧化磷酸化等多项重要的生理和生化过程的关键细胞器。近年来研究表明，线粒体中的一系列代谢过程也与细胞凋亡密切相关，如呼吸链中氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的过度生成、线粒体膜通透性转运孔（permeability transition pore，PTP）异常开放、凋亡诱导因子（apoptosis-inducingfactor，AIF）与线粒体细胞色素C 释放等。因此，线粒体衰退是衰老及相关疾病发生发展的重要原因，以线粒体为细胞内作用靶点，寻找适当的药物和营养素，在衰老及相关疾病防治中具有重要意义。本文以衰老过程中的线粒体退变机制为基础，阐述了线粒体营养素的概念[1, 2]。

二价金属离子转运体DMT1的研究进展

1997年 ,两个研究组分别用表达克隆和定位克隆方法单独地克隆到同一个功能基因 :二价金属离子转运体 (divalentmetaltransporter 1,DMT1)。DMT1是具有 12个跨膜域的糖蛋白 ,在机体各组织广泛分布 ,特别在肠、肝、肾、脑等处有特征分布 ,肠中DMT1定位于十二指肠刷状缘膜表面 ,在其它组织细胞中定位于细胞膜和 或胞浆内内吞小体 (endosome)和溶酶体 (lysosome)的膜上。相关研究已基本证实 ,分布于十二指肠吸收细胞的DMT1可将肠道非血红素铁转运入细胞 ;组织细胞内吞小体膜的DMT1可将内吞小体中已解离铁转入胞浆 ,供细胞利用。DMT1表达主要受膳食铁水平调节。除遗传性血色素沉着症等疾病与DMT1表达过量有关外 ,亦已证实脑铁代谢紊乱相关的一些神经元变性病变与DMT1异常表达有密切联系。深入研究DMT1将为了解金属离子代谢机制提供重要的研究资料。

锌转运体研究进展

锌转运体 ( Zn T)的发现深化了对锌在细胞和分子水平的认识。迄今为止所克隆出的 4种哺乳动物Zn T( Zn T1、Zn T2、Zn T3、Zn T4 )在蛋白结构上具有 6个跨膜域、富组氨酸胞内袢、C,N末端位于胞内等共性。对 Zn T的分布及基本功能进行了初步研究。Zn T1分布广泛 ,位于细胞膜上 ,可使细胞内锌外排 ;Zn T2分布于肠、肾、睾丸 ,Zn T3主要分布于脑、睾丸 ,Zn T4分布于乳腺、脑、睾丸 ,Zn T2、Zn T3、Zn T4均定位于胞内囊泡膜上 ,且功能相似 ,可使细胞内锌转运入囊泡。通过 Zn T对胞内锌的这种外排或胞内转运作用 ,可使细胞避免高锌引发的细胞毒性。涉及锌的非专一性转运体包括二价金属离子转运体 ( DMT1)、调控锌铁的转运体样基因 ( ZIRTL)和人类调控锌铁蛋白 ( h ZIP2 )等。另外 。

改良PCR-RFLP法测定异质性线粒体基因的相对含量

目的 :改进 PCR- RFL P法 ,确认线粒体异质性基因并测定异质性线粒体基因的相对含量。方法 :依据先期实验中克隆测序得到的 ECV 30 4细胞中线粒体基因 (D- L OOP区 )多态性位点 ,采用两轮 PCR法 ,以第 1轮 PCR胶回收产物为模板 ,作第 2轮 PCR,并在第 2轮 PCR中引入限制性内切酶位点 ,酶切产物行琼脂糖电泳 ,测定异质性线粒体基因的相对含量。结果 :ECV30 4细胞中存在 5 13A/ G异质性 ,二者比例约为 1∶ 3。 结论 :确证 ECV30 4细胞中含有 5 13A/ G异质性碱基 ,改良 PCR-RFL P法测定异质性线粒体基因相对含量较为简单可靠 。

异荭草素的药理作用

异荭草素是一种木犀草素糖苷类黄酮化合物,存在于多种药用植物中。异荭草素具有多种药理活性,如抗氧化、抑制炎症发展、改善胰岛素抵抗、弱化肝纤维化发展以及诱导肝癌细胞凋亡等。本文综述了近几年来异荭草素药理作用及相应机制研究的进展,并对如何推进异荭草素在肝癌治疗领域的应用提出了建议和展望。

生物实验室仪器操作与实验安全系统性培训体系建设

研究生在进入实验室初期普遍存在实验仪器操作能力欠缺、安全意识不强等问题,对于实验仪器的维护和保养缺乏专门知识,由此带来人身安全、设备安全和实验环境安全方面的隐患。如何有效提高学生实验仪器操作能力,降低实验仪器损坏率,确保实验安全,已成为研究生阶段第一个亟需解决的问题。生物科学与工程系实验室针对这一问题进行了探索,建立了一套研究生实验仪器操作与实验安全系统性培训体系,极大提高了研究生操作实验仪器的能力,保证了实验室安全、高效、稳定地运行。

自噬发生中的ROS调节机制

活性氧是细胞代谢中产生的有很强反应活性的分子,易将邻近分子氧化,并参与细胞内多种信号转导途径,对相关生理过程进行调控.自噬是真核细胞通过溶酶体机制对自身组分进行降解再利用的过程,在细胞应激及疾病发生等过程中发挥重要作用.本文对活性氧和自噬相关调节进行分类介绍,根据新近研究进展,从活性氧参与的自噬性死亡、自噬性存活以及线粒体自噬3方面探讨了相关信号转导机制,对活性氧作为信号分子参与的自噬调控途径做一总结和介绍.

人肝癌SMMC-7721细胞株部分线粒体基因表达的研究

目的:观察人肝癌SMMC-7721细胞株部分线粒体DNA(mtDNA)基因表达的情况。方法:根据人线粒体DNA(mtDNA)基因序列,利用primer premier 5.0生物软件设计了4对PCR引物,分别是扩增D-loop区、ND6、ATPase8-ATPase6、16sRNA基因,采用RT-PCR方法对SMMC-7721细胞线粒体DNA上D-loop区及其他3个基因的表达进行了检测,并与其在正常人肝细胞株(L02)线粒体中的表达作了比较。结果:我们发现,与正常人肝细胞株(L02)相比,在SMMC-7721细胞中,D-loop区、ND6、ATPase8-ATPase6基因表达总体是增高的,16sRNA基因表达基本不变,同时在同一基因两条链(重链和轻链)之间的表达也存在差异。结论:我们认为,由于线粒体DNA编码的多肽均是氧化磷酸化酶复合物的亚单位,这些基因表达的异常可能造成细胞对氧利用障碍,细胞能量产生减少,成为造成SMMC-7721细胞主要以糖酵解的方式提供能量的重要原因之一。

运动与氧化还原信号调控

活性氧既是细胞内的信号分子,也是引起细胞氧化应激的主要分子。适当强度的运动促进生理水平活性氧的生成,增强机体抗氧化能力,有助于改善代谢、延缓衰老及相关疾病;而过度运动则会导致机体内大量活性氧的产生,造成运动疲劳甚至运动损伤。线粒体是产生活性氧及维护细胞氧化还原稳态的主要细胞器。合理补充线粒体营养素可以维护细胞氧化还原稳态,部分模拟运动的生理效应;同时,能够缓解过度运动引起的运动疲劳,有助于提升运动能力并改善运动损伤。

河南汉族父亲MTHFR基因对母亲不明原因反复自然流产的影响

目的探讨父亲亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因C677T多态性是否与母亲不明原因反复自然流产（uRSA）的发生有关。方法通过聚合酶链式反应一测序（PCR-测序）的方法对329对河南汉族URSA夫妇（观察组）及292对河南汉族健康夫妇（对照组）基因型进行分析。结果无论是在对照组中还是观察组中，男、女之间的MTHFRC677T多态性位点的C和T等位基因频率和各基因型频率分布差异均无统计学意义（P〉0．05）；观察组中男女各方的MTHFRC677T多态性位点的T等位基因频率和含T的各基因型频率均显著高于相应的对照组（P〈0．05），在女性中T等位基因是c等位基因发生URSA风险的2．267倍（95％CI：1．804～2．843），在男性中T等位基因是c等位基因发生uRsA风险的2．239倍（95％CI：1．783～2．811）。夫妻联合基因型分析中，夫妇TT／TT基因型发生URSA的风险最高，是CC／CC基因型夫妇的19．909倍（95％CI：8．608～46．049）。结论父母的MTHFR677C〉T是URSA发生的独立遗传易感因素。

纳米酶在葡萄糖分析检测中的应用研究进展

即时、准确的监控血糖和尿糖的变化对于糖尿病的早期诊断及血糖控制具有重要意义。自从2004年报道金纳米簇具有磷酸转移酶样催化活性以来,多种具备酶样催化活性的纳米材料被发现,包括过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、氧化酶等。与天然酶相比,纳米酶具有成本低廉、制备简单、易于保存运输、环境耐受性高等优点。利用纳米酶进行葡萄糖分析检测有望降低检测成本,提高检测系统稳定性。本文总结了金属纳米颗粒、金属氧化物、金属硫化物、碳基材料以及复合材料等多种纳米酶检测系统在葡萄糖分析检测中的特点、检测限和检测范围,并对纳米酶研究面临的挑战及前景进行展望。

人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38年轻和衰老细胞中线粒体量和mtDNA相对含量以及功能变化的比较

目的培养人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38,比较年轻和衰老细胞中线粒体量和线粒体DNA(mtDNA)相对含量的变化,以及线粒体功能的改变,探讨线粒体与衰老的关系。方法培养人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38;四氮唑盐(MTT)比色法测细胞活力;差速离心分离线粒体,BCA-100Pr定量试剂盒测定线粒体蛋白的含量;竞争PCR法分析mtDNA的相对含量;流式细胞仪测定线粒体膜电位的变化;分光光度法测定线粒体呼吸链氧化酶-NADH氧化酶活性。结果衰老细胞较年轻细胞形成单层时间明显延长,细胞圆缩蜕变,细胞活力明显低于年轻细胞;线粒体膜电位约下降为原来的50%;NADH氧化酶活性也降低,最大反应速度由66.73nmol/(mgprotein·min)降为36.01nmol/(mgprotein·min);衰老细胞线粒体蛋白含量(0.78±0.02mg/ml)高于年轻细胞(0.56±0.03mg/ml);以核18SrDNA为内参,衰老细胞mtDNA相对含量(1.557±0.072)明显高于年轻细胞(1.292±0.068)。结论衰老细胞中,线粒体量和mtDNA相对含量的增高可能是功能下降的一种代偿性反应,为探讨线粒体与衰老的关系提供一定参考。

骨质疏松症发生与防治的线粒体机制

骨质疏松与衰老及许多代谢性疾病密切相关。绝经后妇女体内雌激素水平下降,糖皮质激素类药物的使用,以及航天飞行的失重效应均可诱导骨质疏松症的发生。氧化应激是骨质疏松发生的重要机制,自由基通过调控信号通路或诱发炎症反应影响成骨细胞及破骨细胞的分化、功能和凋亡,而抗氧化剂能有效预防和治疗骨质疏松症。线粒体作为细胞内能量代谢与氧化应激发生的主要部位,在骨质疏松的发生机制中发挥着重要作用,可能是防治骨质疏松症的新靶点。

地高辛原位杂交显示锌转运体3 mRNA在脑、脊髓和脊神经节中的分布

目的:为研究锌转运体3(ZnT3)在神经系统功能中的作用提供形态学依据。方法:制备带有地高辛标记物的ZnT3反义RNA探针,取雄性SD大鼠脑、脊髓和脊神经节行冷冻切片,作ZnT3 mRNA原位杂交组织化学显色,杂交后用AKP标记的抗地高辛抗体显色。结果:脑内ZnT3 mRNA主要分布于海马结构,包括齿状回颗粒细胞和CA1～CA4区的锥体细胞,在梨状皮质、扣带后皮质中也有分布,显示的细胞较小;脑干中也有ZnT3 mRNA分布,面神经核处分布较多,网状结构中有少量分布;脊髓灰质前角内有少数胞体较大的细胞呈ZnT3 mRNA阳性;脊神经节内的多数神经元呈ZnT3 mRNA强阳性。结论:ZnT3 mRNA主要分布于海马、大脑皮质、杏仁核、脑干网状结构等可塑性较强结构和周围神经神经元中,提示ZnT3可能在学习、记忆、初级感觉传入和肌运动调控等方面发挥重要作用。