河流型水牛热休克蛋白表达量及其基因多态性对精液品质的影响

为了研究热休克蛋白对河流型水牛精液品质的影响,试验选取年龄相近的摩拉、尼里/拉菲种公牛各8头,采集鲜精检测精子活力,各分为高活力组(≥0.65)和低活力组(<0.65),每组4头。分别提取试验牛的鲜精总蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白印记(Western bolt)、蛋白灰度分析并计算热休克蛋白60(HSP60)、热休克蛋白70(HSP70)的相对表达量,对HSP70基因CDS区多态性位点与精液品质性状进行相关性分析。结果:(1)HSP60、HSP70蛋白在2个品种牛的精液中均有表达;高活力组与低活力组的HSP60蛋白相对表达量无显著差异(P>0.05),高活力组HSP70蛋白相对表达量显著高于低活力组(P<0.05)。(2)HSP70基因CDS区多态性位点与精液品质性状存在相关性。在C602T位点,摩拉CC基因型采精量最多(P<0.05),活精子数最多(P<0.05),CT基因型精子抗冻性最强(P<0.05);尼里/拉菲CC基因型精子活力最高(P<0.05),活精子数最多(P<0.05),精子抗冻性最强(P<0.05)。在A1284T位点,摩拉AA基因型活精子数最多(P<0.05)。结论:研究结果进一步验证了活力高的精子HSP70基因表达量高;摩拉、尼里/拉菲公牛HSP70基因CDS区有3个碱基对出现核苷酸多态性,核苷酸多态性产生的不同基因型对其采精量、活精子数、精子抗冻性等性状有影响。初步推断HSP70基因多态性位点可作为选择河流型水牛精液品质性状的辅助遗传标记。

陆川猪与杜洛克猪正反交F1代UCP3基因表达差异研究

为培育优质猪品系,提高猪肉品质,本试验探索了陆川猪与杜洛克猪正反交F1代及其亲本陆川猪肌内脂肪含量和UCP3基因表达差异。试验分别选取陆川猪、陆川猪与杜洛克猪正反交F1代各8头,采用实时荧光定量RT-PCR方法测定肌肉中UCP3基因mRNA在不同品种猪中的表达量,并测定眼肌面积和肌内脂肪含量,以分析UCP3基因的表达量与脂肪和眼肌面积的相关性。结果显示,3组猪在眼肌面积、肌内脂肪含量和UCP3基因mRNA表达量上均差异显著(P<0.05),且正反交F1代均遗传了杜洛克猪体型大、陆川猪肌内脂肪含量高的优势,UCP3基因的表达量与猪眼肌面积呈极显著负相关,与肌内脂肪含量呈极显著正相关。初步推断UCP3基因可作为影响猪脂肪性状的主效基因。

广西巴马小型猪ANK1基因启动子克隆及其活性分析

【目的】克隆广西巴马小型猪ANK1基因启动子,确定其活性核心区,为研究ANK1基因启动子与肉质性状的相关性及构建动物疾病模型打下基础。【方法】通过在线软件对ANK1基因启动子的转录因子结合位点进行预测,根据转录因子结合位点设计特异引物扩增不同长度的ANK1基因启动子片段,并利用双荧光素酶试剂盒检测其荧光值,以确定不同ANK1基因启动子片段的活性。【结果】发现ANK1基因启动子存在1个转录起始位点(TSS)、2个Cp G岛和多个转录因子结合位点,并以此作为ANK1基因启动子的分段依据,将其分割为P638、P791、P1113、P1163、P1648、P1694、P1796和P2074等8个不同长度的目的片段。成功克隆获得的8个ANK1基因启动子片段经KpnⅠ和HindⅢ双酶切、T4真核表达载体连接、细胞转染等方法构建8个双荧光素酶重组报告基因,双荧光素酶试剂盒检测结果显示,广西巴马小型猪ANK1基因启动子在P1796片段活性最强,与其他片段存在显著差异(P<0.05)。【结论】成功克隆获得广西巴马小型猪ANK1基因启动子的8个片段,且利用双荧光素酶试剂盒检测确定其核心启动子区域出现在P1796片段。

摩拉、尼里/拉菲种公牛促性腺激素释放激素受体(GnRHR)基因序列多态性检测及基因型分析

为了分析摩拉、尼里/拉菲种公牛促性腺激素释放激素受体(GnRHR)基因的遗传多态性,试验对28头摩拉种公牛、40头尼里/拉菲种公牛采用PCR扩增、测序、高分辨率熔解曲线检测的方法对GnRHR基因进行遗传多态性检测。结果表明:摩拉、尼里/拉菲种公牛GnRHR基因存在相同的SNP位点,分别是A13 342G、T13 355G、A13 406T、T17 221C。其中前三个SNP位点位于第一内含子,最后一个SNP位点位于第三外显子,该突变位点使氨基酸编码由酪氨酸变为组氨酸。对于基因分型,摩拉、尼里/拉菲种公牛却出现不同结果,摩拉种公牛13 342位点有2种基因型AA、AG,频率分别为0.607 1,0.329 2;13 355位点有2种基因型TT、TG,频率分别为0.714 3,0.285 7;13 406位点有2种基因型AA、AT,频率分别为0.750 0,0.250 0;17 221位点有2种基因型TT、TC,频率分别为0.750 0,0.250 0。尼里/拉菲种公牛13 342位点有3种基因型AA、AG、GG,频率分别为0.300 0,0.375 0,0.325 0;13 355位点有3种基因型TT、TG、GG,频率分别为0.575 0,0.325 0,0.100 0;13 406位点产生3种基因型AA、AT、TT,频率分别为0.575 0,0.325 0,0.100 0;17 221位点有3种基因型TT、TC、CC,频率分别为0.600 0,0.325 0,0.075 0。尼里/拉菲种公牛检测群体4个SNP位点均处于HardyWeinberg平衡状态(P>0.05)。

河流型水牛热休克蛋白70的原核表达及其对精液抗冻性的影响

试验旨在克隆河流型水牛热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)基因的CDS区序列,构建HSP70原核表达载体,诱导表达HSP70融合蛋白,进一步研究HSP70蛋白对水牛精液抗冻性的影响。以摩拉水牛精子基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增HSP70基因CDS区序列,将PCR产物与pET30a质粒连接构建重组原核表达质粒,诱导表达HSP70融合蛋白,将获得的表达蛋白作为稀释液组分添加到水牛精液中制作冷冻精液并评定其活力。结果显示,试验成功扩增获得HSP70基因CDS区长为2 155bp的片段;SDS-PAGE及Western blotting分析显示,在70ku处出现一条明显条带,且表达产物可与相应的抗体发生反应;对添加有HSP70蛋白的水牛冷冻精液活力评定结果显示,终浓度为2、4、8mg/mL的HSP70能提高冷冻精液活力,且8mg/mL HSP70组冻精活力最高,但各组间差异均不显著(P>0.05)。综上所述,本试验成功表达了水牛HSP70蛋白,获得了高纯度、有活性的HSP70融合蛋白,外源添加HSP70蛋白可提高水牛冷冻精液的活力,为进一步研究水牛HSP70蛋白的抗冻性保护机理奠定了理论基础。

动物组织DNA试剂盒提取水牛精液基因组DNA效果观察

为了快速、高效地提取水牛精液基因组DNA,试验采用动物组织DNA试剂盒并对一些步骤进行优化,以此方法抽提DNA。结果表明：使用动物组织DNA试剂盒可以获得水牛精液基因组DNA,DNA纯度（OD260/OD280值）为1.71±0.22,浓度为（61.38±20.68）ng/μL,水牛精液基因组DNA可直接用于PCR反应。

摩拉、尼里/拉菲种公牛促性腺激素释放激素受体(GnRHR)基因序列多态性与精液质量性状的相关分析

为了研究促性腺激素释放激素受体（GnRHR）基因与摩拉、尼里/拉菲种公牛精子质量性状的相关性,试验对28头摩拉、40头尼里/拉菲种公牛的GnRHR基因多态性位点与其2011—2016年精液质量性状的关系进行统计分析。结果表明：GnRHR基因分别与摩拉、尼里/拉菲种公牛精液质量性状具有相关性。摩拉种公牛A13 342G位点,AA型的射精量显著高于AG型（P〈0.05）,AG型的精子密度显著高于AA型（P〈0.05）;T17 221C位点,TT型的冻精活力显著高于TC型（P〈0.05）。尼里/拉菲种公牛T13 355G位点,TG型的冻精活力显著高于TT、GG型（P〈0.05）;A13 406T位点,AA、AT型的鲜精活力显著高于TT型（P〈0.05）,AA、AT型的鲜精活力无显著差异（P〉0.05）;AT型的冻后活力显著高于AA、TT型（P〈0.05）。说明GnRHR基因可作为摩拉、尼里/拉菲种公牛精液质量性状的重要分子标记。

蛋白酶抑制剂E-64对猪卵母细胞体外成熟的影响

为了研究猪卵母细胞成熟过程中在成熟液中添加蛋白酶抑制剂E-64对猪卵母细胞体外成熟的影响,试验采用在成熟液中添加不同浓度的E-64进行体外培养44 h后统计成熟率,计算卵母细胞的成熟率,确定最佳浓度为10μmol/L。将10μmol/L组、未添加组的卵母细胞进行固定、染色,鉴定卵母细胞核成熟情况。结果表明:在猪卵母细胞成熟液中添加10μmol/L的E-64,成熟率和核成熟率显著高于未添加组,并能显著提高猪孤雌卵母细胞的分裂率和囊胚发育率。

不同因素对广西地区摩拉、尼里/拉菲种公牛精液质量的影响分析

为了研究不同品种、不同年龄结构、不同温度对广西地区河流型水牛种公牛精液质量的影响,选取摩拉种公牛33头、尼里/拉菲种公牛44头,对其2013—2019年的原精及冷冻精液质量检测纪录进行分析。结果:(1)摩拉种公牛的射精量显著高于尼里/拉菲种公牛(P<0.05),尼里/拉菲种公牛的原精活力显著高于摩拉种公牛(P<0.05)。(2)同一品种不同年龄比较,3~5岁摩拉、尼里/拉菲种公牛的精子密度、精子抗冻性最高(P<0.05),10~16岁尼里/拉菲种公牛的射精量最高(P<0.05)。(3)摩拉、尼里/拉菲种公牛在平均气温15℃以下原精活力最低,平均气温24℃原精活力最高(P<0.05)。(4)将种公牛冻精解冻后活力与原精活力、原精密度建立回归方程:摩拉种公牛为Y 1=0.269+0.08X 2+0.001X 3;尼里/拉菲种公牛为Y 3=0.305+0.02X 5+0.001X 6。将每头每次冻精剂数与射精量、原精活力、原精精密度建立回归方程:摩拉种公牛为Y 2=-144.601+14.266X 1+72.950X 2+17.357X 3;尼里/拉菲种公牛为Y 4=-102.824+17.844X 4+2.778X 5+15.848X 6。

桑树代替豆粕的日粮对荷斯坦肉公牛生产性能及经济效益的影响

试验研究荷斯坦公肉牛日粮分别添加0%、15%、30%的桑树代替部分或全部豆粕对其生产性能和经济效益影响,将24头荷斯坦公肉牛随机分为3组,每组8头进行饲养试验。结果显示:测定全珠桑树粗蛋白质(干物质计)含量为26.7%;公肉牛饲喂添加15%(试验I组)和30%(试验II组)桑树代替部分或全部豆粕日粮,其体增重与对照组比较无显著差异(ρ>0.05),但饲料成本降低,若按每千克体增重的饲料成本计算,试验I组和试验II组每千克体增重饲料费分别比对照组降低0.34元和1.06元。

河流型水牛热休克蛋白70(HSP70)基因CDS序列的多态性分析

为了研究河流型水牛HSP70基因CDS序列的多态性,试验首先从摩拉水牛、尼里/拉菲水牛、槟榔江水牛、地中海水牛冷冻精液中抽提基因组DNA,以基因组DNA为模板扩增获得河流型水牛HSP70基因,对其进行基因克隆,测序,序列分析;其次对26头摩拉水牛、43头尼里/拉菲水牛HSP70基因CDS序列进行测序、高分辨率熔解曲线检测分析。结果显示:河流型水牛的HSP70基因CDS序列长度为1927bp,4个品种HSP70基因CDS序列相似度高达99%以上;摩拉、尼里/拉菲种公牛HSP70基因CDS序列存在相同的SNP位点,分别是C602T、A708T、A1284G,并产生不同的基因型。摩拉公牛HSP70基因CDs区602bp位点、尼里/拉菲602bp位点处于Hardy-Weinberg不平衡状态。试验结果说明了HSP70基因在进化上具有高度保守性,但在同一群体中存在多态性。

巴马小型猪TNF-α基因的克隆与相关生物学信息分析

本研究旨在分析巴马小型猪TNF-α(tumor necrosis factor-alpha)基因的遗传变异情况。实验采用RT-PCR和克隆的方法成功扩增TNF-α基因的编码区序列,同时对TNF-α基因和相应的蛋白序列进行生物信息学分析。结果表明,巴马小型猪TNF-α基因编码区全长为699 bp,编码232个氨基酸;与Gen Bank中已发表的猪TNF-α基因(登录号:NM_214022.1)序列进行比对,未发现核苷酸碱基突变;编码的232个氨基酸分子量为25 253.9,理论等电点为5.44,不存在信号肽,但存在跨膜螺旋结构。经过序列相似性分析,巴马小型猪的TNF-α基因与猪、人、马、牛、家犬、绵羊同源性比较结果表明其具有较强的保守性。巴马小型猪的TNF-α基因与野猪的亲缘关系一致。

猪ANK1新的可变剪接体功能预测、组织表达谱分析与真核表达载体构建

为进一步了解猪ANK1基因,本研究以广西巴马猪作为实验对象,分析ANK1基因结构与功能,并利用实时荧光定量PCR方法,分析ANK1基因在广西巴马小型猪11个不同组织(心脏,肝脏,脾脏,肺脏,肾脏,大肠,小肠,胰腺,皮下脂,胃,背最长肌)中的表达水平。组织表达谱分析结果表明ANK1基因在11个组织中均有表达,mRNA表达量表现为:胰腺>心脏>背最长肌>胃>大肠>肝脏>肾脏>小肠>脾脏>肺脏>脂肪。ANK1基因编码的蛋白通过生物信息学分析表明,编码156个氨基酸,存在跨膜结构和跨膜信号肽,分子量为17 799.27,理论等电点6.31,α螺旋和无规则卷曲所占比例比较大。通过酶切技术成功获得p EGFP-ANK1重组质粒并转染到C2C12细胞中,于48 h拍照发现细胞发出荧光,说明ANK1基因真核表达载体构建成功。