油桐油体蛋白基因的克隆及序列分析

油桐油体蛋白与油桐脂肪酸储藏密切相关。通过构建油桐cDNA文库和EST文库,用分子生物学手段分离克隆出两个油桐油体蛋白基因的全长cDNA序列。通过分析表明,两个油体蛋白基因的全长cDNA分别为738 bp、838 bp,各包含1个完整的CDS,分别编码137个、154个氨基酸。分别命名为VF_oleⅠ,VF_oleⅡ。通过与其它物种的19条油体蛋白氨基酸序列比对,油桐油体蛋白基因分别与麻疯树oleosin 3和麻疯树oleosin 2的相似性最高,分别为84%、82%。通过软件预测表明,油桐油体蛋白等电点分别为10.315、10.335,都存在跨膜结构域,且存在信号肽剪切位点,中部都存在一个较长的疏水区,C末端都是以α-螺旋为主。

油桐delta 8脱饱和酶基因的全长cDNA克隆及序列分析

桐油是制备生物柴油的优势原料。delta 8脱饱和酶基因与植物膜脂、鞘磷脂的生物合成及细胞信号传递途径有关。通过简并PCR扩增、3’RACE、5’RACE及编码区扩增获得了油桐delta 8脱饱和酶的全长c DNA序列。该基因全长1 787 bp,ORF的长度为1 344 bp,编码447个氨基酸。经过网上比对分析,发现油桐delta 8脱饱和酶与其它植物的此基因具有较高同源性,其中与蓖麻脂肪酸去饱和酶相似度达83%。研究结果为揭示油桐油脂合成途径及分子定向育种奠定基础。

油桐亲环素基因全长cDNA的克隆及序列分析

亲环素基因广泛分布于各种生命体中,植物亲环素在植物生物学、胁迫应答、抗病原体免疫等方面起重要作用。根据油桐EST文库中的已知部分亲环素基因序列,通过5’RACE和RT-PCR,得到一个油桐亲环素全长cDNA序列。此基因全长为681 bp,包含一个长为519 bp的完整CDS,编码172个氨基酸,将该基因命名为vf_cyp。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白质相对分子量18 038.5 Da,理论等电点8.68。通过预测分析表明该蛋白无跨膜结构,不存在信号肽切割位点,二级结构以β折叠和无规卷曲为主,分别占36.05%和52.91%,具有典型的肽脯氨酰顺反异构酶活性区及植物亲环素基因特有的7个氨基酸插入序列KS/MGKPLH,通过亲缘进化分析表明油桐亲环素氨基酸序列与橙、杂柑、毛果杨亲环素基因的氨基酸序列相似性分别达到94%、94%、93%。

干旱胁迫对两种油桐幼苗生长、气体交换及叶绿素荧光参数的影响

为了探究干旱胁迫对两种油桐(三年桐和千年桐)幼苗光合生理特性的变化及响应,采用盆栽试验,研究不同水分处理(正常供水、轻度干旱、中度干旱、重度干旱)对油桐幼苗生长、叶片气体交换及叶绿素荧光参数的影响。结果表明:与对照相比,轻度干旱胁迫对两种油桐生长、气体交换及叶绿素荧光参数无明显影响(P>0.05);中度干旱及重度干旱使两种油桐的叶绿素SPAD值、生长量、净光合速率(P_n)、气孔导度(G_s)、蒸腾速率(T_r)、气孔限制值(L_s)、最大净光合速率(P_(nmax))、光饱和点(LSP)、表观量子效率(AQY)、暗呼吸速率(R_d)、最大光化学效率(F_v/F_m)、实际光化学量子效率(Φ_(PSⅡ))、电子传递速率(ETR)及光化学猝灭系数(q_P)显著下降(P<0.05),且在重度干旱胁迫下迅速下降,胞间CO_2浓度(C_i)、水分利用效率(WUE)、光补偿点(LCP)、初始荧光(F_o)、非光化学猝灭系数(NPQ)显著升高(P<0.05);中度干旱胁迫下油桐幼苗P_n的降低是由气孔因素及光合机构活性降低的非气孔因素共同引起的,而重度干旱胁迫下光合作用的下降主要是由光合机构活性降低的非气孔因素引起的。三年桐的光合机构活性及光合效率高于千年桐,对干旱胁迫的适应性较千年桐强。

根外追肥对油桐幼苗生长、光合作用及叶绿素荧光参数的影响

研究不同叶面肥对油桐幼苗生长、光合作用、叶绿素含量及叶绿素荧光参数等的影响,为油桐苗期施肥管理和高产栽培提供参考。选取一年生‘葡萄桐’幼苗为试材进行砂培盆栽模拟培养试验,测定叶片喷施尿素和磷酸二氢钾(KH_2PO_4)后的光合生理参数,叶绿素荧光及生长量等指标。结果表明:油桐幼苗具有较高净光合速率(P_n),平均值可达12.2μmol·m^(-2)·s^(-1);叶片喷施尿素和KH2PO4能够显著提高油桐幼苗叶片的净光合速率(Pn),气孔导度(G_s)、光饱和点(LSP)、表观量子效率(AQY)、光系统Ⅱ(PSⅡ)最大光化学效率(F_v/F_m)、电子传递速率(ETR)及生物量的积累,降低了初始荧光(F_o)、CO_2补偿点;根外追肥对羧化效率(CE)、叶绿素含量、株高等指标的提高略有增加,叶面喷施尿素的作用比KH_2PO_4的作用更明显;叶面喷施尿素能使油桐幼苗的叶面积增加59.70%,而KH_2PO_4对油桐幼苗地径的增加优于尿素。与对照相比,根外追肥能够提高油桐幼苗的光合能力,从而增加了生物量的积累。

4个油桐品种光合特性的日变化研究

为了研究油桐光合效率的高低及不同品种之间光合特性的差异,筛选高光效的油桐品种,利用Li-6400便携式光合测定系统,测定了4个油桐品种光合指标的日变化。结果表明:(1)‘葡萄桐’、‘小米桐’、‘对年桐’的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)日变化均呈单峰曲线,‘大米桐’的Pn、Gs、Tr日变化呈双峰曲线;(2)4个品种的胞间CO2浓度(Ci)日变化呈不规则的"V"字型;(3)4个品种净光合速率日变化平均值大小排序为:‘葡萄桐’>‘小米桐’>‘对年桐’>‘大米桐’;(4)影响油桐净光合速率值的主要生态生理指标大小依次为:蒸腾速率>胞间CO2浓度>光合有效辐射>气孔导度。油桐具有较高的光合效率,不同品种之间的光合特性有所差异。

基于油桐种子3个不同发育时期转录组的油脂合成代谢途径分析

油桐是我国重要的木本油料植物,过去对油桐的研究主要集中于栽培和常规育种,与油桐种仁油脂合成相关的分子机理研究还未见报道。文章采用RNA-seq技术对油桐种子油脂合成的3个不同时期的转录组进行比较,获得了大量差异表达的Unigene序列。在此基础上,通过GO分类和Pathway富集性分析将这些差异表达Unigene归类于128个代谢途径,其中包含与油脂合成相关的脂肪酸生物合成和甘油磷脂代谢途径。桐酸经脂肪酸生物合成途径合成后通过甘油磷脂代谢途径以桐油的形式贮存。将这两个代谢途径的Unigene序列在KEGG数据库中进行比对,获得了一些关键酶的同源蛋白质。文章通过对编码这些同源蛋白质的基因在油桐种子油脂合成期的表达模式进行分析,以期为油桐油脂合成,尤其是桐酸合成机理的解析提供理论参考,并为油桐的遗传改良提供潜在的基因资源,从而提高油桐的单位面积产量。

油茶DGAT1基因的全长cDNA序列克隆及分析

DGAT酶是催化TAG合成途径即Kennedy途径中唯一的限速酶。根据已报道油茶DGAT1基因部分cDNA序列设计引物,利用RT-PCR和RACE技术,对油茶DGAT1基因进行克隆及序列分析。结果表明:该基因序列全长为2 046 bp,包含1个完整的1 548 bp ORF及269 bp 5’UTR和229 bp 3’UTR,编码515个氨基酸;该基因被命名为co-dagt1。经过比对分析,发现油茶的DGAT1基因具有DGAT1基因特有的保守序列和相关特征,而且与其他植物的DGAT1基因具有较高的相似性,并对其蛋白质序列和理化性质进行了分析。

油茶Pht1;1基因克隆及其表达分析

以油茶湘林4号为材料,通过RT-PCR和RACE的方法克隆出油茶磷酸转运子Pht1基因家族一个成员的全长cD-NA序列,命名为CoPht1;1(GenBank登录号:JX403969),通过实时定量PCR的方法检测了不同磷浓度下该基因在根系中的表达水平。结果表明:CoPht1;1 CDS长度为1626 bp,编码542个氨基酸,与其他物种的Pht1氨基酸序列具有较高的相似性,其中与夹竹桃科长春花的Pht1相似性最高,达到88%;蛋白质二级结构和拓扑结构预测表明,CoPht1;1具有跨膜蛋白的主要特征,与其他物种的Pht1具有一致性;实时定量RT-PCR结果表明,油茶Pht1基因的表达受低磷诱导,并在受磷胁迫处理(P浓度为0.1 mmol/L)15 d时表达量最高。

油茶丙二酰单酰CoA:ACP转酰基酶基因的克隆与原核表达

【目的】油茶种仁含油率较低且易遭逆性环境等的影响,这些都严重影响和制约了油茶产业的快速发展。丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶是脂肪酸合成酶(FASⅡ)复合体的组成酶之一,在脂肪酸合成中起着装载作用,它的酶促反应产物丙二酰单酰ACP是脂肪酸合成关键组成部分。开展该基因的功能研究,能为油茶的分子遗传育种奠定基础。【方法】以油茶品种‘华硕’种子为材料,借助其种子转录组和表达谱数据库,通过RACE技术,克隆丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶基因并对该基因进行生物信息学分析。利用常规的酶切连接技术构建基因的原核表达载体,并利用α酮戊二酸脱氢酶(KDH)偶联系统测定表达产物的酶活性。【结果】丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶基因的全长c DNA 1 867 bp,含有1 131 bp的开放读码框,编码376个氨基酸,具有58个氨基酸长度的叶绿体转运肽,该基因被命名为Co MCAT(Gen Bank登录号KJ910337)。在malonyl-Co A结合位点和ACP结合位点上分别存在高度保守的基序"GQGXQ"和"GXSXG"。原核表达载体p ET30a-Co MCAT在BL21(DE3)细胞中被成功地诱导表达,目的重组蛋白分子量约为40 k Da。酶活性分析表明,重组蛋白Co MCAT的最佳催化温度为30℃,最佳p H为7.0,比酶活性约为2.384 U·μg-1。【结论】以本实验室构建的油茶转录组数据库为基础,首次克隆获得油茶MCAT基因的全长c DNA序列,构建其原核表达载体在宿主细胞BL21(DE3)中成功诱导表达目的蛋白,并对重组蛋白进行初步的酶活性分析。研究结果为今后进一步深入开展和揭示油茶MCAT基因在油脂合成的代谢过程中的作用奠定基础。

三年桐EST-SSR标记的开发与种质遗传多样性分析

以三年桐品种对年桐发育中的种子为材料,构建c DNA文库,获得3202个原始EST序列,经过去除冗余和低质量序列后,获得1047条非冗余单一序列,利用MISA软件从其中的173个非冗余EST序列中搜索得到212个SSR位点。其中,二核苷酸重复类型为主导（68.39%）,其次是三核苷酸重复类型（25.94%）,其优势基元为AG/CT（43.87%）、AT/AT（19.34%）和AGC/GCT（5.66%）。针对可设计引物的68个序列进行EST-SSR引物设计,结合PCR扩增和数据分析,鉴定出14对多态性标记,用该14对引物对169份三年桐种质资源进行遗传多样性检测,共得到41个等位基因（Na）,平均每对引物扩增出2.93个等位基因,期望杂合度（He）变幅为0.08~0.63,平均值为0.33,多态性信息含量（PIC）变幅为0.08~0.56,平均值为0.3,表明14对EST-SSR标记多态性较高,能较好地反映三年桐种质的遗传多样性。三年桐种质资源按群体进行非加权配对算术平均法（UPGMA）聚类分析,群体间的相似度变幅为0.9604~0.9986,遗传距离变幅为0.0022~0.0404,表明三年桐群体间的遗传多样性相对较低,亲缘关系较近。对169份三年桐种质资源个体进行聚类分析,结果显示不同地理种源的遗传关系缺乏明显的地理结构。

翅荚木组培快繁技术的研究

以翅荚木的腋芽以及翅荚木幼苗嫩茎为外植体,进行组培快繁技术研究,结果表明:翅荚木适宜的初代培养基为MS+6-BA 1.0 mg.L-1+IBA 0.05 mg.L-1;继代培养基以MS+6-BA 0.5 mg.L-1+IBA0.1 mg.L-1+KT0.5 mg.L-1培养,效果好;生根培养则以MS+IBA0.05 mg.L-1+NAA0.05 mg.L-1+KT0.1 mg.L-1培养基的生根效果最好。

油桐丙二酰单酰CoA:ACP转酰基酶的克隆与序列分析

为了深入了解油桐丙二酰单酰辅酶A酰基载体蛋白转酰基酶(Malonyl Co A:ACP transacylase,MCAT)在油脂合成代谢过程中的作用,利用RT-PCR技术克隆获得了油桐MCAT基因序列,且命名为Vf MCAT,并利用相关生物软件对该基因序列及其相应蛋白质进行了生物信息学分析。结果表明:Vf MCAT的CDS长为1 179 bp,编码392个氨基酸;该蛋白与蓖麻和亚麻的MCAT同源性均达85%,存在"GXSXG"和"GQGXQ"两个高度保守的motif,在系统进化关系上,其与蓖麻和亚麻的亲缘关系最为接近;分析其氨基酸序列后发现,Vf MCAT的分子量约为41.67 KDa,理论等电点p I为8.43,是一个含有一个跨膜结构域的可溶性稳定蛋白;对其二级和三级结构的预测结果表明,该蛋白主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,且最有可能在线粒体中发挥其主要作用,文中由此推测,Vf MCAT在叶绿体中参与了油桐脂肪酸合成代谢。

油茶脂酰辅酶A脱氢酶基因的克隆与表达分析

以国审油茶(Camellia oleifera)良种‘华硕’种子为材料,在已构建的转录组和表达谱数据库基础之上,采用RACE技术,克隆获得油茶脂酰辅酶A脱氢酶基因的全长c DNA序列,命名为Co ACAD(基因登录号KJ910338)。该基因c DNA全长为2702 bp,含有2487 bp的开放读码框,编码828个氨基酸,分子量为92.4113 k D,理论等电点p I为8.47,具有2个比较明显的跨膜区和酪氨酸蛋白激酶活性位点LVHGDFRIDNLVF,存在5个亚结构域;在Co ACAD基因c DNA全长序列的基础上构建表达载体,其中原核表达载体在宿主细胞BL21(DE3)中成功诱导表达,获得表观分子量约为93 k D的目的蛋白;实时荧光定量PCR分析表明,Co ACAD基因在果实膨大期和成熟期上调表达,预示着Co ACAD基因可能在种子发育过程中参与能量供应过程的调控。

菲油果LEAFY基因的表达模式及启动子克隆

LEAFY(简称LFY)是植物花分生组织特征基因,在植物由营养生长向生殖生长转变过程中起着重要作用,是启动开花的枢纽。菲油果是一种新兴的果树资源,为研究菲油果LFY基因(FsLFY)的表达调控规律,本研究通过实时荧光定量PCR技术研究了FsLFY基因的时空表达模式,并通过染色体步移技术克隆了该基因的启动子序列。荧光定量PCR结果表明,FsLFY基因在菲油果花蕾不同发育阶段以及其他组织器官中均有表达。在花蕾中,小蕾期最高,中蕾期最低;组织器官中,营养枝茎段最高,花瓣最低。FsLFY基因启动子序列长度为2436 bp(GenBank登录号:KF766536),运用PLACE、PlantCARE等在线软件对其序列进行顺式作用元件分析,结果显示该序列不仅含有CAAT-box、TATA-box等核心启动子元件,而且还具有响应水分、光、赤霉素(GA)以及其他功能未知的顺式调控元件,表明FsLFY基因的表达受多种外界环境条件的调控。本研究为阐明菲油果的开花机理,以及通过分子育种手段使菲油果早花早果奠定了理论基础。

油桐种胚再生体系的建立

为了建立快速有效的油桐再生体系,以"葡萄桐"种胚为试材,研究了贮藏方式、消毒时间、培养基及培养条件对油桐种胚成苗的影响。结果表明:种子沙藏与在自然条件下贮藏对油桐种胚成苗的影响无明显差异;种胚的最佳消毒处理为0.1%的升汞浸泡3 min;将种胚接种在1/2MS+IAA 0.5 mg/L的培养基中成苗率最高,为98%;在培养基中加入6-BA易使种胚产生大量的愈伤组织,不利于油桐胚再生体系的建立;培养基的最适pH值为5.5;与遮光处理相比,光照能缩短种胚再生体系建立的周期。

油桐乙酰辅酶A羧化酶BC亚基全长cDNA克隆及序列分析

以葡萄桐的近成熟种子为材料,根据油桐转录组测序结果设计引物,采用RT-PCR技术克隆了油桐乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因的全长c DN A序列。该基因c DNA序列全长1 605 bp,编码534个氨基酸。推导出的BC亚基氨基酸序列蛋白的等电点p I为7.98,相对分子量58 262.0 Da,稳定系数为38.13,生物信息学分析表明,此蛋白含有2个比较明显的跨膜区,是一个不稳定的非分泌蛋白。模体搜索结果表明在BC上具有ATP结合位点。三级结构中有16个α螺旋,3个部分形成一个内凹的结构。

枣花蕾总RNA提取方法的比较

为了探究枣花蕾总RNA提取的最优方法,以沾化冬枣的花蕾为材料,利用改良CTAB法、Trizol法和2种RNA提取试剂盒(PureLinkTMRNA小提试剂盒和北京奥莱博生物技术有限公司提供的植物RNA提取试剂盒)分别提取花蕾的总RNA,并对RNA浓度和电泳图谱进行比较分析,利用奥莱博生物技术有限公司提供的植物RNA提取试剂盒法可提取到纯度较高,完整性好的总RNA,并可用于Northern杂交、cDNA文库构建和半定量RT-PCR等分子生物学试验。

油桐100个优良家系种子含油率及脂肪酸组成分析

用石油醚作溶剂,采用索氏抽提法测定了油桐100个优良家系种子含油率,并采用GC法分析了桐油的脂肪酸组成。结果表明:油桐含油率主要分布在50.00%~60.00%之间,最大值62.55%,最小值46.95%,平均值55.24%;桐油基本由桐酸、亚油酸、油酸、硬脂酸、棕榈酸和亚麻酸组成,含量范围依次为75.23%~87.19%(α-桐酸69.83%~84.11%,β-桐酸1.66%~10.14%)、5.40%~9.03%、3.20%~9.42%、1.71%~3.64%、1.86%~2.96%、0.28%~0.79%,平均值依次为81.97%(α-桐酸78.07%,β-桐酸3.91%)、6.88%、5.88%、2.41%、2.30%和0.56%。研究表明:油桐优良家系种子均有较高含油率,不同家系的含油率及桐油的α-桐酸、β-桐酸、亚油酸、油酸含量差异较大,而硬脂酸、棕榈酸和亚麻酸的含量差异较小。

油桐种子FAD2基因全长cDNA序列分析

油桐种子中FAD2催化形成的亚油酸是合成桐油酸的直接原料,研究油桐种子中的FAD2基因对提高桐油酸的产量具有实际意义。将油桐对年桐近成熟种子cDNA文库中的16个FAD2克隆子进行CAP3拼接,再进行BLAST比对,并进行DNAMAN分析,结果表明所克隆的基因序列为FAD2全长cDNA序列,其长度为1 537 bp,含有1个完整的编码序列,长度为1 146 bp(106～1 255 bp),编码383个氨基酸。酶蛋白相对分子质量44 144.4 u,等电点为8.57,氨基酸序列N端有6个残基的信号肽序列,有5个跨膜结构域,N端、C端及中间各有一段表现为强亲水性,酶活性中心为3个保守的组氨酸簇。在系统进化上,油桐FAD2基因与千年桐的亲缘最近,与蓖麻、乌桕、橡胶树、麻疯树等大戟科植物的亲缘关系较近,与油橄榄、花生、芝麻等植物的亲缘较远,与油茶的亲缘关系更远。