LPS与ATP共同诱导小鼠原代腹腔巨噬细胞焦亡模型的建立

目的:探索脂多糖(LPS)和三磷酸腺苷(ATP)共同诱导小鼠原代腹腔巨噬细胞焦亡模型的最佳条件。方法:采用流式细胞仪F4/80和CD-11b染色检测巨噬细胞纯度,Annexin V-PE/7-AAD双染色法筛选出LPS和ATP共同诱导细胞焦亡的最适浓度及时间。巨噬细胞随机分为control组、LPS组、ATP组和LPS+ATP组;Western blot检测GSDMD、caspase-1、caspase-11、NLRP3、ASC、pro-IL-1β、pro-IL-18和HMGB1蛋白表达水平;ELISA检测培养上清中IL-1β和TNF-α表达水平;透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)观察巨噬细胞焦亡形态。结果:巨噬细胞的纯度达到90%;500 ng/ml LPS 24 h+5 mmol/L ATP 4 h为诱导巨噬细胞焦亡的最佳组合方式;LPS+ATP组的GSDMD、caspase-1、caspase-11、NLRP3、ASC、pro-IL-1β、pro-IL-18和HMGB1的蛋白表达量明显高于对照组(P<0.05);培养上清中IL-1β和TNF-α表达量显著高于对照组(P<0.05);电镜下可观察到明显的焦亡特征。结论:成功建立了LPS和ATP共同诱导小鼠原代腹腔巨噬细胞的焦亡模型,为深入探讨免疫细胞焦亡的分子机制提供了稳定的细胞模型。

噬血细胞性淋巴组织细胞增多症患者外周血中高迁移率族蛋白B1的表达及临床意义

目的探讨高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)在噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(hemophagocytic lymphohistiocytosis,HLH)患者体内的表达情况及临床意义。方法收集2018年7月至2019年5月重庆医科大学附属第二医院收治的HLH患者26例相关临床资料,健康志愿者30例作为对照。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测外周血中HMGB1蛋白水平,实时荧光定量PCR检测外周血中HMGB1 mRNA表达水平,分析HMGB1水平与其他临床指标的相关性以及HMGB1对于诊断HLH的灵敏度、特异度及最佳诊断阈值。结果HMGB1在HLH患者外周血中的浓度较健康志愿者明显升高[(1992.77±883.74)vs(1237.49±272.85)ng/mL,P<0.01]。HLH患者组HMGB1 mRNA的相对表达量为(4.56±2.10)倍,较健康志愿者组的(2.34±1.32)倍明显升高(P<0.05)。HLH患者血清中HMGB1含量与红细胞计数(r=-0.5146,P<0.05)、血红蛋白水平(r=-0.4536,P<0.05)、血小板计数(r=-0.5055,P<0.05)均呈负相关。骨髓中发现噬血现象的HLH患者,其HMGB1水平显著高于骨髓中未发现噬血现象的HLH患者[(2246.27±935.14)vs(1422.38±317.33)ng/mL,P<0.05]。利用HMGB1诊断HLH的曲线下面积为0.8122(P<0.05),最佳阈值为1522 ng/mL,灵敏度为69.23%,特异度为86.67%。结论HMGB1在HLH患者的外周血中高表达,有望用于噬血细胞性淋巴组织细胞增多症的诊断、病情评估和预后分析。

芽胞杆菌CQBS03抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表达

为了探讨柑桔溃疡病生防菌芽胞杆菌Bacillus CQBS03菌株TasA基因的功能,采用PCR方法从CQBS03基因组DNA中扩增出编码TasA基因的全长DNA序列,并构建pEASY-E1/TasA原核表达载体,经大肠杆菌Escherichia coli表达获得TasA基因的融合表达蛋白,纸碟法检验融合蛋白对柑桔溃疡病菌Xanthomonas citri citri的抑制作用。结果显示,CQBS03菌株的TasA基因包含1个786 bp的完整开放阅读框(GenBank登录号为JQ309841),编码261个氨基酸残基;该序列与来源于解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens的1个已知同源TasA基因序列FJ713580的相似性达99.75%。原核表达产物经SDS-PAGE分析,检测到约31 kD的融合蛋白;纯化后的融合蛋白对柑桔溃疡病菌有明显的抑制作用,72 h后抑菌圈直径达11.5 mm。研究表明TasA基因是生防菌芽胞杆菌CQBS03抑制柑桔溃疡病菌的功能基因之一,并且该基因对原核表达宿主没有抑制作用,具有较好的开发利用前景。