喉癌顺铂耐药细胞株的建立及干性生物学特性分析

目的建立人喉癌顺铂(CDDP)耐药细胞株并鉴定其干细胞生物学特性,探讨其对CDDP耐药机制及与干细胞的关系。方法以药物浓度梯度递增法诱导建立人喉癌Hep-2的顺铂耐药细胞株Hep-2/CDDP;倒置显微镜观察细胞的形态;CCK-8法检测细胞IC50及耐药指数;无血清细胞球体培养观察成球能力;实时定量RTqPCR法检测MDRl/P-gp、ABCG2、CD44、CD133 mRNA的表达情况;Western blot法检测MDRl/P-gp、ABCG2、CD44、CD133蛋白表达情况。结果顺铂体外缓慢诱导历时12个月建成的Hep-2/CDDP耐药细胞株,与亲本Hep-2细胞相比,细胞形态改变明显;耐药性能稳定耐药指数为5.43;无血清球体培养实验示细胞成球率升高(P<0.05);RT-qPCR和Western blot结果表明耐药相关基因MDRl/P-gp、ABCG2表达上调(均P<0.05);干性相关标记基因CD44、CD133升高(均P<0.05)。结论 Hep-2/CDDP细胞株具有稳定的顺铂耐药性,是研究喉癌顺铂耐药和逆转机制的良好模型,且其耐药机制与顺铂诱导的肿瘤干细胞有关,可为研究逆转耐药提供参考。

喉癌顺铂耐药细胞株RNA测序及整合分析

目的顺铂(cisplatin,DDP)是喉癌患者最常用的化疗药物之一,但是疗效欠佳,可能原因是多药耐药性的产生。本研究将筛选喉癌Hep-2细胞与Hep-2/DDP细胞株之间差异表达的RNA测序数据,包括信使RNA(messenger RNA,mRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)及微小RNA(microRNA,miRNA),并整合分析三者之间的相互关系,探讨喉癌多药耐药机制。方法采用HiSeq4000测序平台对Hep-2及Hep-2/DDP细胞的lncRNA+mRNA建库测序,HiSeq2500测序平台进行miRNA建库测序;GenCLiP 2.0分析3种差异表达RNA的功能;并对miRNA与mRNA、lncRNA与miRNA、lncRNA与mRNA分别进行整合分析。RT-PCR实验验证相关miRNA和lncRNA在细胞株之间表达差异。结果 Hep-2及Hep-2/DDP细胞之间差异表达基因共有1 513个转录本,其中上调基因399个,下调基因580个,主要富集的功能有DNA损伤修复、活性氧簇、细胞死亡、凋亡、细胞周期静止和上皮间充质转换等。构建已知的分子相互作用网络的核心节点为上调基因血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)和下调基因蛋白激酶B1(protein kinaseB1,PKB1,又名AKT1);筛选出差异表达的lncRNA共4个,分别是MALAT1、LINC01315、AC092757.3和LINC01822;筛选到63个差异表达miRNA,其中下调miRNA有38个,上调miRNA有25个;整合分析表明,miRNA和lncRNA广泛参与DDP多药耐药机制。RT-PCR结果表明,MALAT1(0.12±0.02)、AC092757.3(0.35±0.02)和MIR155(0.37±0.01)在Hep-2/DDP细胞中表达下调,P值分别为0.036、0.006和0.005;而MIR34A在Hep-2/DDP细胞(3.58±0.01)中表达上调,P=0.011。结论喉癌多药耐药与启动DNA损伤修复、抑制细胞周期以及上皮间充质转化等密切相关,其中VEGFA和AKT1可能是核心基因。miRNA和lncRNA参与DDP多药耐药机制形成,MIR155、MIR34A、MALAT1和AC092757.3可能是主要调节的非编码RNA。

原花青素通过自噬途径增强喉癌细胞对顺铂化疗敏感性的研究

目的:探究原花青素(OPC)对喉癌TU686细胞自噬的影响,并从自噬和凋亡的角度讨论OPC增强喉癌细胞对顺铂(DDP)化疗敏感性。方法:CCK-8法检测不同浓度OPC和DDP对TU686细胞活力的影响;实验分组TU686细胞分为CON组、DDP组,OPC组、MIX组;Annexin-V-FITC/PI双染行流式细胞术检测各实验组对细胞凋亡的作用;细胞免疫荧光染色检测细胞自噬的形成;Western blot检测自噬及凋亡相关蛋白的表达;使用自噬抑制剂(3-MA)研究自噬对细胞凋亡的影响。结果:CCK-8结果显示OPC和DDP作用TU686细胞24h后,都以浓度依赖性方式抑制TU686细胞增殖活力。LC3-Ⅱ蛋白染色观察到,与CON和DDP组、OPC组相比,MIX组作用TU686细胞后显著诱导自噬形成(P<0.05)。流式检测结果提示相比CON组,DDP组、OPC组和MIX组诱导TU686细胞凋亡,其中MIX组促凋亡作用明显高于OPC组和DDP组(P<0.05),使用3-MA预处理后,OPC组及MIX组对喉癌细胞的凋亡作用显著下降(P<0.05)。Western blot的结果提示DDP、OPC及MIX组的LC3-Ⅱ与Caspase-3蛋白的表达明显高于CON组(P<0.05),而其中MIX组较之于单药组,其LC3-Ⅱ与Caspase-3表达的增加亦差异有统计学意义(P<0.05)。使用3-MA抑制自噬后,LC3-Ⅱ的表达显著下降(P<0.05),Caspase-3的表达伴随LC3-Ⅱ发生降低,但Caspase-3表达的下降只在OPC及MIX组具有显著意义(P<0.05)。结论:OPC可以通过诱导喉癌TU686细胞自噬,促进其凋亡,进而增强喉癌细胞对顺铂化疗敏感性。

顺铂诱导上皮间质转化在耐药喉癌细胞中的作用

目的:观察顺铂(CDDP)诱导的人喉癌耐药细胞(hep-2/CDDP)中的上皮间质转化(EMT)情况,探讨EMT在喉癌顺铂耐药中的机制。方法:利用hep-2细胞和前期培养的hep-2/CDDP细胞株;Transwell、划痕实验检测细胞的侵袭迁移能力;分别提取人喉癌顺铂耐药细胞hep-2/CDDP及其亲代细胞hep-2mRNA、总蛋白,应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、Western blot方法检测上皮表型E-cadherin、Zo-1,上皮间质转化转录因子Snail、Slug、Twist1,间质表型分子Vimentin mRNA及蛋白表达水平。结果:Transwell结果显示耐药细胞穿过基质胶的数量高于亲本细胞(P<0.05),划痕实验示hep-2/CDDP细胞划痕愈合面积百分比高于hep-2细胞(P<0.05),hep-2/CDDP细胞上皮表型E-cad、Zo-1mRNA及蛋白表达水平较hep-2细胞降低(均P<0.01),EMT转录因子Snail、Slug表达水平较hep-2细胞升高(均P<0.01),Twist1蛋白水平表达无明显变化(P>0.05),间质表型Vimentin mRNA及蛋白表达水平较hep-2细胞升高(均P<0.01)。结论:hep-2细胞的耐药性和侵袭迁移能力改变与顺铂诱导的上皮间质转变可能有关,抑制EMT相关通路可能为逆转喉癌顺铂耐药提供新思路。

MiR-150调控Nanog对鼻咽癌侧群细胞增殖、侵袭的影响

目的检测MiR-150在鼻咽癌侧群(SP)细胞中的表达,并探讨其是否通过调控靶基因Nanog促进鼻咽癌侧群细胞的增殖与侵袭。方法采用SYBR Green实时定量荧光聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测MiR-150及Nanog在鼻咽癌侧群细胞和非侧群(NSP)细胞中的表达情况;并通过瞬时转染miR-150 inhibitor至SP细胞、miR-150 mimic至NSP细胞中,w estern blotting检测Nanog的表达情况;进一步通过CCK-8实验、Transw all实验检测鼻咽癌侧群细胞增殖、侵袭能力的变化,数据处理采用两独立样本t检验。结果 qRT-PCR检测结果表明,M iR-150在SP细胞(0.99±0.05)较NSP细胞(0.59±0.02)中表达水平升高(t=8.06,P<0.000 1),Nanog在鼻咽癌SP细胞(0.99±0.47)较NSP细胞(0.49±0.05)表达升高(t=7.5,P<0.000 1);SP细胞转染M iR-150 inhibitor(0.46±0.03)较对照组(1.01±0.07)Nanog表达下调(t=6.85,P=0.000 5)、CCK-8实验示增殖受抑制、Transw ell侵袭实验示侵袭能力减弱(114.40±5.14 vs 57.30±4.29,t=8.5,P<0.000 1);NSP细胞转染MiR-150 mimic(1.01±0.06)组较对照组(0.48±0.04)Nanog表达上调(t=6.16,P=0.000 8),增殖及侵袭能力增强。结论鼻咽癌SP细胞中M iR-150与Nanog呈高表达,M iR-150可通过调控靶基因Nanog促进鼻咽癌侧群细胞的增殖与侵袭。

干扰核转录因子Snail增强喉癌耐药细胞顺铂敏感性的研究

目的:探讨核转录因子Snail对喉癌顺铂耐药细胞株(Hep-2/CDDP)顺铂敏感性的影响。方法:采用小干扰RNA(si-RNA)技术靶向沉默Hep-2/CDDP细胞中Snail的表达;采用实时定量荧光聚合酶链式反应(RT-qPCR)法检测其干扰效率;免疫荧光法检测干扰组(si-Hep-2/CDDP)和对照组(Hep-2/CDDP)中Snail蛋白的表达情况;CCK-8法检测干扰组和对照组对0、1、2、4、8、16μg/ml不同浓度的顺铂抑制率;Western blot法检测干扰组和对照组si-Snail处理前后Snail、E-cadherin、MDR1蛋白的表达情况。结果:RT-qPCR结果显示,靶向沉默Snail后干扰组细胞Snail表达较对照组下降(67.85±9.50)%;免疫荧光实验示,干扰组细胞核及细胞质中Snail荧光强度均下降;CCK-8实验示,不同浓度顺铂作用后,与耐药细胞Hep-2/CDDP相比,干扰组抑制率较对照组升高;Western blot示Snail干扰组蛋白水平较耐药细胞组表达下调(P<0.05),同时上皮表型标记E-cadherin表达上调,多药耐药蛋白MDR1表达下调(均P<0.05)。结论:干扰核转录因子Snail可上调E-cadherin的表达,降低耐药细胞Hep-2/CDDP耐药蛋白MDR1的表达,增强喉癌耐药细胞的顺铂敏感性。

侵犯外半规管的中耳腺瘤一例

患者女，24岁，因左耳反复流脓伴听力下降15余年于2016年4月17日入院。纤维耳镜下见左侧外耳道黏性分泌物，鼓膜中央型大穿孔，鼓室内黏膜水肿，有脓性分泌物，可见一表面光滑息肉样新生物自中鼓室后上方凸入外耳道。颞骨CT示左侧鼓室、鼓窦气房内软组织密度影填充，未见明确骨质破坏，听小骨边缘稍模糊；左侧外耳道亦见软组织密度影填充（图1）。

浅谈培养学生做现代文阅读题的教学策略

现代文阅读是语文课程的组成的重要部分,它的主要作用是使学生养成阅读的习惯,在语文考试中现代文阅读一般占总分数的30%,由此可见,现代文阅读的能力是语文学习的重要环节,要使学生提高现代文阅读的能力,需要研究探索正确的教学策略。